معلومة

كيفية تجميع ثلاثة nts 60mer بواسطة pcr؟

كيفية تجميع ثلاثة nts 60mer بواسطة pcr؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

صباح الخير،

أنا جديد في علم الأحياء الجزيئي. قد يكون السؤال سخيفًا لكني أرغب في معرفة الإجابة. لدي ثلاثة أليغنوكليوتيد صناعي واحد بطول 60 مللي. وهي العلامة 1 - 3. هدفي هو تجميع هؤلاء الثلاثة معًا بواسطة pcr. لذلك صممت اثنين من البادئات التي تتداخل 18nts من كل علامة 1 وعلامة 2 ثم العلامة 2 والعلامة 3 (لقد ذكرت اتجاه أجهزة التمهيدي الخاصة بي). ما هي أفضل طريقة للتجميع. قرأت عن تخليق الحمض النووي المكون من خطوتين والمعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل. لكن أود أن أعرف المزيد عن هذا.

إذا كان لديك أي أسئلة فلا تتردد في النشر. شكرا ونتطلع إلى إجاباتك القيمة

[]


لتجميع TAG oligos الخاص بك بواسطة PCR ، ستحتاج إلى إعادة تصميم الاشعال الخاص بك بحيث تكون مكملة لـ TAG oligos حيث تعمل بوليمرات الحمض النووي عن طريق إضافة النيوكليوتيدات إلى الطرف 3 من خيط DNA.

سيبدو التصميم الخاص بك كما يلي:

الآن مع هذا التصميم ، لن تكون قادرًا على تجميع كل شيء معًا لأن تكامل TAG-3 للبرايمر 2 يقدم فقط 5 نهايات يمكن تمديدها ، وهو ما لا يستطيع بوليميراز الحمض النووي الخاص بك القيام به. لذلك يمكنك إما طلب المكمل العكسي الكامل لـ TAG-3 oligo أو تصميم برايمر 3 الذي من شأنه أن ينحل في نهاية 3 'من TAG-3 لتضخيم TAG-3.

مع كل هذه الأجزاء ، يجب أن تكون قادرًا على تجميع كل شيء في تفاعل واحد ، ولكن اعتمادًا على العملية النهائية الخاصة بك ، قد تضطر إلى تنقية المنتج محل الاهتمام لأن التفاعل الفردي سيولد مواد وسيطة (1 ، 2 ، 3 ، 1 + 2 ، 2 + 3).


أود أن أقترح استخدام تجميع جيبسون. أنا لست خبيرًا ولكن هذا هو نوع المشكلة التي تم تصميمها لحلها. ربما هناك طريقة ما للقيام بذلك عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل لكنني أتوقع أن يكون الأمر صعبًا للغاية.

انظر هذا الاقتباس من تلك الصفحة (تأكيدي):

نصيحة: "خياطة" الأجزاء معًا باستخدام Oligos

عندما تحتاج إلى تسلسل متداخل بين منتجين من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، فإن إحدى الطرق هي "تجميع" عدة أوليجوس معًا. هذه التقنية مفيد بشكل خاص لإدخال المروجين ، والمُنهي ، والتسلسلات القصيرة الأخرى في التجميع ويستخدم عندما يكون الجزء المراد إدخاله طويلًا جدًا بحيث لا يمكن تضمينه في بادئات PCR المتداخلة (> 60 نقطة أساس) ولكنه قصير جدًا بحيث لا يصنع الجزء الخاص به (<150 نقطة أساس) ).

يرجى ملاحظة أن طريقة تصميم البادئات "الغرز" ومقاديرها التي يجب تضمينها في تفاعل جيبسون تختلف عن تلك المستخدمة في البادئات PCR العادية. تم نشر التفاصيل في (Nat Methods 2010 ؛ 7: 901-3).

نصيحة: عدد الأجزاء التي تم تجميعها في نفس الوقت

يمكن تجميع شظايا متعددة في تفاعل واحد. ومع ذلك ، فقد لاحظت بعض المعامل انخفاضًا حادًا في معدل النجاح عند تجميع أكثر من 5 أجزاء في المرة الواحدة.

تحديث

يبدو أن هناك أشخاصًا يجادلون بأن جيبسون مستحيل بأجزاء قصيرة أو أنه يعمل بشكل جيد. يوجد المزيد من المعلومات حول هذا هنا وهنا وهنا. نظرًا لطبيعة رد فعلك المعقدة نسبيًا ، أعتقد أن جيبسون قد يوفر لك الوقت. لكن الأشخاص الآخرين المرتبطين هناك يدعون أن تفاعل البوليميراز المتسلسل يعمل بشكل أفضل.

التحديث 2

تحتوي إجابة GaelC أعلاه على نصيحة منهجية أفضل / أكثر تحديدًا حول تجميع PCR.