معلومة

10.8: الطحالب الخضراء - سلائف نباتات الأرض - علم الأحياء

10.8: الطحالب الخضراء - سلائف نباتات الأرض - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

العقدية

حتى وقت قريب ، كانت جميع حقيقيات النوى الضوئية تعتبر أعضاء في مملكة بلانتاي. هذا لأنه بصرف النظر عن قدرتها على التقاط الطاقة الضوئية وإصلاح ثاني أكسيد الكربون2، تفتقر إلى العديد من السمات الهيكلية والكيميائية الحيوية التي تميز النباتات عن الطلائعيات. تحتوي الطحالب الخضراء على نفس الكاروتينات والكلوروفيل أ و ب كنباتات برية ، بينما تحتوي الطحالب الأخرى على أصباغ ملحقة وأنواع مختلفة من جزيئات الكلوروفيل بالإضافة إلى الكلوروفيل أ. وبالتالي ، أصبحت النباتات البرية والطحالب الخضراء وثيقة الصلة بها الآن جزءًا من مجموعة أحادية الخلية تسمى Streptophyta.

تشمل الطحالب الخضراء المتبقية ، والتي تنتمي إلى مجموعة تسمى Chlorophyta ، أكثر من 7000 نوع مختلف تعيش في المياه العذبة أو قليلة الملوحة ، في مياه البحر ، أو في بقع الثلج. حتى أن عددًا قليلاً من الطحالب الخضراء تعيش على التربة ، بشرط أن تكون مغطاة بطبقة رقيقة من الرطوبة يمكنها العيش فيها. توفر نوبات الجفاف الدورية ميزة انتقائية للطحالب التي يمكنها تحمل الإجهاد المائي. قد تكون بعض الطحالب الخضراء مألوفة بالفعل ، على وجه الخصوص سبيروجيرا و desmids. تحتوي خلاياها على البلاستيدات الخضراء التي تعرض مجموعة متنوعة مذهلة من الأشكال ، وتحتوي جدرانها الخلوية على السليلوز ، كما تفعل النباتات البرية. بعض الطحالب الخضراء عبارة عن خلايا مفردة ، مثل الكلوريلا و كلاميدوموناسمما يزيد من غموض تصنيف الطحالب الخضراء ، لأن النباتات متعددة الخلايا. طحالب أخرى ، مثل أولفا (تسمى عادة خس البحر) ، تشكل مستعمرات (الشكل 1).

تكاثر الطحالب الخضراء

تتكاثر الطحالب الخضراء على حد سواء لاجنسيًا ، عن طريق تجزئة أو تشتيت الجراثيم ، أو جنسيًا ، عن طريق إنتاج الأمشاج التي تندمج أثناء الإخصاب. في كائن وحيد الخلية مثل كلاميدوموناس، لا يوجد انقسام بعد الإخصاب. في متعدد الخلايا أولفا، ينمو الطور البوغي عن طريق الانقسام الفتيلي بعد الإخصاب (وبالتالي يظهر تناوب الأجيال). على حد سواء كلاميدوموناس و أولفا تنتج الأمشاج الجلدية.

تشاراليس

تشتمل نباتات Charophytes على العديد من رتب الطحالب المختلفة التي تم اقتراح كل منها على أنها أقرب الأقارب لنباتات الأرض: Charales و Zygnematales و Coleochaetales. يمكن تتبع عائلة Charales إلى 420 مليون سنة. تعيش في مجموعة من موائل المياه العذبة وتتنوع في الحجم من بضعة مليمترات إلى متر في الطول. الجنس الممثل هو شارا (الشكل 25.8) ، وغالبًا ما يُطلق عليها اسم عشب المسك أو عشبة الظربان بسبب رائحتها الكريهة. تشكل الخلايا الكبيرة ثالوس: الجذع الرئيسي للطحالب. تتكون الفروع التي تنشأ من العقد من خلايا أصغر. تم العثور على الهياكل التناسلية للذكور والإناث على العقد ، وللحيوانات المنوية سوط. بالرغم ان شارا تبدو سطحية مثل بعض النباتات البرية ، والفرق الرئيسي هو أن الجذع لا يحتوي على نسيج داعم. ومع ذلك ، يعرض Charales عددًا من السمات المهمة للتكيف مع الحياة على الأرض. ينتجون المركبات اللجنين و سبوروبولين، وتشكيل plasmodesmata التي تربط سيتوبلازم الخلايا المجاورة. على الرغم من أن دورة حياة Charales هي haplontic (الشكل الرئيسي هو أحادي الصيغة الصبغية ، وتتكون البيضة الملقحة ثنائية الصبغيات ولكن لها وجود قصير) ، تتشكل البيضة ، ولاحقًا ، البيضة الملقحة ، في غرفة محمية على النبات الأم أحادي العدد.

Coleochaetes متفرعة أو تكشف عن أشكال متعددة الخلايا. يمكن أن ينتجوا عن طريق الاتصال الجنسي وغير الجنسي ، لكن دورة الحياة هي في الأساس هاجس. يشير تحليل تسلسل الحمض النووي المكثف الأخير للفطريات إلى أن Zygnematales أكثر ارتباطًا بالأجنة من Charales أو Coleochaetales. تشمل عائلة Zygnematales الجنس المألوف سبيروجيرا، وكذلك desmids. مع تحسن تقنيات تحليل الحمض النووي وظهور معلومات جديدة عن علم الجينوم المقارن ، سيستمر فحص الروابط التطورية بين نباتات الفحم والنباتات الأرضية لإنتاج حل مرضٍ لغموض أصل نباتات الأرض.


النباتات أنا

في الطحالب ، تعتبر المشيجيات هي أكبر مراحل دورة الحياة وأكثرها وضوحًا.

الطور المشيجي أحادي العدد وينتج أمشاج أحادية العدد عن طريق الانقسام.

يتم نقل العناصر الغذائية من الأم إلى الجنين من خلال خلايا نقل المشيمة.

تخضع الخلايا ثنائية الصبغية التي تسمى الخلايا البوغية للانقسام الاختزالي لتكوين جراثيم أحادية الصيغة الصبغية.

الإناث الجاميتانغيا ، التي تسمى أركونيا ، تنتج البيض وتكون موقع الإخصاب.

تُثبت الجذور المشيمية في الركيزة.

يشكل Sphagnum ، أو & quot؛ queat moss & quot ، رواسب واسعة من المواد العضوية المتحللة جزئيًا والمعروفة باسم الخث.

يتكون اللحاء من الخلايا الحية ويوزع السكريات والأحماض الأمينية والمنتجات العضوية الأخرى.

إنها تمكن نباتات الأوعية الدموية من امتصاص الماء والمواد المغذية من التربة.

يتم تصنيف الأوراق إلى نوعين:
Microphylls ، يترك مع وريد واحد.
Megaphylls ، أوراق ذات نظام وعائي شديد التشعب.


خلفية

الستيرولات هي مكونات حيوية لجميع الخلايا حقيقية النواة [1]. في النباتات العليا ، يلعبون دورًا هيكليًا في حيوية الخلية ، وتكوين الأجنة ، وتشكيل الأنماط ، وانقسام الخلايا ، والتكوين الحيوي للبلاستيدات الخضراء ، وتعديل النشاط وتوزيع البروتينات المرتبطة بالغشاء مثل الإنزيمات والمستقبلات [2 ، 3]. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر الستيرولات مقدمة للعديد من جزيئات الإشارات التي تنظم النمو والتطور في النباتات والحيوانات ، مثل هرمونات تساقط الحشرات [4] ، وهرمونات الستيرويد في الثدييات [5] ، وهرمونات براسينوستيرويد النباتية (BR) [6].

تنتمي الستيرولات إلى فئة من الأيزوبرينويدات المشتقة من إيزوبنتنيل بيروفوسفات (IPP) ، وهي مقدمة عالمية للأيزوبرينويدات. في الحيوانات والفطريات ، يعد مسار حمض الميفالونيك السيتوبلازمي (MVA) هو الطريق الوحيد للتخليق الحيوي لـ IPP ، وهو اللبنة الأساسية للانوستيرول ، والذي يتم استقلابه بعد ذلك إلى كولسترول في الحيوانات وإرغوستيرول في الفطريات [7]. في النباتات العليا ، يمكن اشتقاق IPP إما عن طريق مسار MVA أو مسار 1-deoxyxylulose 5-phosphate أو methylerythritol phosphate (MEP) ، على الرغم من أن الأول هو المساهم الرئيسي في التخليق الحيوي للستيرول [8 ، 9]. في أرابيدوبسيس، يمكن تصنيف طفرات التخليق الحيوي للستيرول إلى مجموعتين متميزتين: طفرات BR-المستقلة ، والتي تكون معيبة في الجينات في المسار من سيكلو أرتينول إلى 24-ميثيلينلوفينول [10] ، والطفرات المعتمدة على BR ، والتي تكون معيبة في الجينات في الجزء الأخير من مسار التخليق الحيوي للستيرول (من 24-ميثيلينيلوفينول إلى كامبستيرول ، والذي يعتبر بمثابة مقدمة لـ BRs) [11]. إلى جانب كونها بمثابة طليعة BR ، يبدو أن الستيرولات تلعب وظائف تأشير مميزة أثناء تطور النبات ، حيث لا يمكن إنقاذ الأنماط الظاهرية للطفرات التخليقية الحيوية للستيرول عن طريق إضافة BR الخارجية [12].

يعد التنظيم المشترك لتخليق الستيرول وإنتاج الأحماض الدهنية (FA) ضروريًا للحفاظ على توازن التخليق الحيوي مقابل دوران الأغشية أثناء النمو الخلوي [13]. في الحيوانات ، يتم تنظيم الستيرولات و FAs بشكل متناسق من خلال نظام التغذية المرتدة بوساطة عائلة محفوظة من عوامل النسخ تسمى بروتينات ربط عنصر الستيرول التنظيمي (SREBPs) ، والتي تتحكم في سلسلة من إنزيمات التخليق الحيوي للكوليسترول الداخلي ، FA ، ثلاثي الجلسرين (TAG) ، و الفوسفوليبيد [14 ، 15]. يرتبط SREBP المنشط بعناصر استجابة الستيرول في المحفز و / أو مناطق المحسن للجينات المستهدفة ويحث على نسخ ما لا يقل عن 30 جينة تخليق الكوليسترول والدهون (خاصة تلك الإنزيمات التي تحد من معدل الترميز ، مثل هيدروكسي ميثيل جلوتاريل CoA اختزال ، HMGR ونوع I FA synthase ، FAS) [16]. أدى التلاعب بهذا التسلسل التنظيمي في الفئران المعدلة وراثيًا إلى زيادات قدرها 6 و 22 ضعفًا في محتوى الكوليسترول ومحتوى TAG ، على التوالي ، وبالتالي الكبد الدهني الضخم [17].

تعد الطحالب الدقيقة مادة وسيطة واعدة لإنتاج مستدام وقابل للتطوير للوقود الحيوي [18] ومع ذلك ، فإن القليل من سلالات الطحالب الدقيقة الموجودة في الطبيعة تتمتع بمجموعة واسعة من السمات التي يتطلبها مخطط إنتاج واسع النطاق وتنافسي اقتصاديًا [19]. لذلك من الضروري تحديد الجزيئات والآليات التي تنظم نمو الطحالب الدقيقة وتطورها واستجابات الإجهاد لتحسين الإجهاد. تُظهر الستيرولات في الطحالب الدقيقة تنوعًا هائلاً بسبب الدرجة العالية من عدم تجانس النشوء والتطور ، والعدد الهائل من الأجناس ، والمسافة التطورية الطويلة بين العديد منها [20 ، 21]. لقد ثبت منذ فترة طويلة أن تكوين الستيرول في الطحالب الدقيقة يختلف باختلاف مرحلة النمو أو طيف الضوء أو درجة الحرارة ، مما يشير إلى أدوار مهمة لكنها غير معروفة إلى حد كبير للستيرولات [22]. لذلك ، فإن التلاعب في التخليق الحيوي للستيرول وتنظيمه يوفر إمكانية لإنتاج الدهون الهندسية. قد يوفر استكشاف الآلية التنظيمية لتكوين الدهون المعتمدة على الستيرول في الطحالب الدقيقة استراتيجيات وأهدافًا جديدة لتحسين إنتاج الدهون في الطحالب الدقيقة. ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن الأدوار ، والتركيب الحيوي ، وتنظيم الستيرولات في الطحالب الدقيقة ، وعلى وجه الخصوص ، ما إذا كان يتم تنظيم عملية التمثيل الغذائي للستيرول و FA وكيف يتم تنظيمها بشكل مشترك.

النانوكلوروبسيس النيابة. هي جنس من الطحالب الدقيقة أحادية الخلية التمثيل الضوئي التي تنتمي إلى heterokonts. يتم توزيعها على نطاق واسع في البيئة البحرية وكذلك في المياه العذبة وشديدة الملوحة. هذه الطحالب ذات أهمية صناعية لأنها تنمو بسرعة ويمكنها تصنيع كميات كبيرة من TAG و FA متعدد غير مشبع عالي القيمة (على سبيل المثال ، حمض eicosapentaenoic) [23]. جينومات أنواع متعددة من الزيتية النانوكلوروبسيس النيابة. تم تسلسلها وتعليقها [23-27]. استخدام الطحالب الصناعية الدقيقة الزيتية N. Oceanica IMET1 كنموذج ، هدفت هذه الدراسة إلى تحديد تركيبة الستيرول ومسار التخليق الحيوي في الطحالب الدقيقة ، والتحقيق في دور التخليق الحيوي للستيرول في التمثيل الضوئي والنمو ، ودراسة تأثير إمداد الضوء والنيتروجين ، وللتحقق من آثار مستويات الستيرول. على تراكم FA. تعمل النتائج التي توصلنا إليها على توسيع فهم وظيفة الستيرول في الطحالب الدقيقة ويجب أن تساعد الهندسة الوراثية أو العمليات المنطقية للإنتاج القائم على الطحالب الدقيقة للوقود الحيوي أو المنتجات الحيوية الأخرى ذات القيمة المضافة.


هيكل وآلية إنزيم تشالكون أيزوميراز النباتي الفريد تطوريًا

يحفز إيزوميراز Chalcone (CHI) التدوير الجزيئي للكالكون المركب بواسطة chalcone synthase (CHS) إلى (2S) -naringenin ، مركب أساسي في التخليق الحيوي لأصباغ الأنثوسيانين ، محرضات ريزوبيوم جينات الإيماء ، و فيتواليكسينز المضادة للميكروبات. هيكل بلوري 1.85 لدقة البرسيم CHI في مركب مع (2S) -naringenin يكشف عن رواية طية شطيرة β ذات وجه مفتوح. حاليًا ، توجد البروتينات ذات التسلسلات الأولية المتماثلة في النباتات العليا فقط. تحدد طوبولوجيا شق الموقع النشط الكيمياء الفراغية لتفاعل الدوران. يقترح الهيكل والتحليل الطفري آلية يقوم فيها تكامل الشكل للشق الملزم بإغلاق الركيزة في شكل مقيد يسمح للتفاعل بالمضي قدمًا مع ثابت معدل الدرجة الثانية يقترب من الحد الذي يتم التحكم فيه بالانتشار. يثير هذا الهيكل أسئلة حول التاريخ التطوري لهذا الإنزيم النباتي الفريد من الناحية الهيكلية.


2. المواد والأساليب

2.1 ظروف استزراع الطحالب

P. tricornutum (CCMP2561) ، التي تم الحصول عليها من مجموعة الثقافة للمركز الوطني Provasoli-Guillard لثقافة العوالق النباتية البحرية ، مختبر Bigelow لعلوم المحيطات ، تمت صيانته واستزراعه في وسط F / 2 يحتوي على 20 جم / لتر ملح البحر. تم الإشارة إلى السلالة على أنها Pt1 بنمط شكلي مغزلي (De Martino et al. ، 2007). لفترة وجيزة ، تم تلقيح 10 مل من وسيط F / 2 السائل بخلايا من ألواح أجار ونمت الطحالب هوائيًا في قوارير سعة 50 مل عند 23 درجة مئوية لمدة 6 أيام (المصافحة اليدوية مرتين يوميًا) مضاءة بضوء مستمر 30 ميكرومتر. 2 ثانية -1 (ضوء أنبوبي فلورسنت أبيض بارد ، من الأعلى). تم بعد ذلك تلقيح الخلايا الطحلبية بنسبة 10 ٪ (حجم / حجم) في قوارير سعة 250 مل للنمو مع اهتزاز مداري عند 150 دورة في الدقيقة في شاكر مداري (Zhichu) وإضاءة ثابتة تبلغ 30 ميكرومتر. تم استخدام خلايا الطحالب التي نمت إلى المرحلة الأسية المتأخرة كبذور للتجارب.

لمعالجة الحرمان من النيتروجين (ND) ، تم حصد البذور وغسلها مرتين باستخدام وسط F / 2 الذي يفتقر إلى النيتروجين ، وإعادة تعليقها في هذا الوسط. تم استخدام الخلايا المعاد تعليقها في وسط F / 2 (نيتروجين مليء ، NR) كعنصر تحكم. كلاهما كان له رقم خلية بداية يبلغ 1.5 × 10 6 مل -1 ونما لمدة 4 أيام مع اهتزاز مداري عند 150 دورة في الدقيقة وإضاءة ثابتة تبلغ 30 ميكرومتر م 2 ث -1. للمقارنة بين النوع البري (WT) والسلالات المعدلة وراثيا P. tricornutum، تم تلقيح الخلايا على عدد من الخلايا البادئة 5 × 10 5 مل -1 وتم السماح لها بالنمو لمدة 12 يومًا مع اهتزاز مداري عند 150 دورة في الدقيقة وإضاءة ثابتة تبلغ 30 ميكرومترًا في الدقيقة −2 ثانية -1.

2.2 الاستنساخ وتحليل السيليكو P. tricornutum DGATs

للحصول على تسلسل تشفير كامل الطول لـ PtDGAT1، تم تحديد مناطقها غير المترجمة لأول مرة عن طريق التضخيم السريع 5ʹ و 3ʹ لنهايات cDNA (RACE) -PCR باستخدام SMARTer RACE 5ʹ / 3ʹ Kit (TaKaRa). بعد ذلك ، تم استخدام أزواج التمهيدي لتضخيم تسلسل الترميز كامل الطول ، والذي تم التحقق منه عن طريق التسلسل وإيداعه في NCBI GenBank (رقم الانضمام MN061782). تسلسل PtDGAT2A عبر PtDGAT2D و PtDGAT3 تم استردادها من NCBI GenBank (JX469835 و JQ837823 و JX469836 و JX469837 و XM_002184438).

تم إجراء محاذاة تسلسل DGAT polypeptides من كائنات مختلفة باستخدام ClustalX2.1 (http://www.clustal.org/clustal2/) وتم إنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام MEGA6 (Tamura et al. ، 2013). تم توقع حلزونات الغشاء من PtDGAT باستخدام TMHMM 2.0 (//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).

2.3 عزل الحمض النووي الريبي والكمي في الوقت الحقيقي PCR

تم إجراء الاستخراج الكلي للحمض النووي الريبي (من حوالي 10 7 خلايا طحلبية) وإزالة الحمض النووي الملوث باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي (TaKaRa). بعد توليف cDNA ، تم إجراء PCR في الوقت الفعلي الكمي (qPCR) على 7500 نظام PCR سريع في الوقت الفعلي (أنظمة بيولوجية مطبقة) مع SYBR ® Premix Ex Taq ™ II (TaKaRa) ، باتباع إجراءاتنا الموصوفة سابقًا (Wei et al . ، 2017). يتم سرد تسلسلات التمهيدي المستخدمة في qPCR في الجدول S1. مستوى تعبير mRNA لـ PtDGAT تم تطبيع الجينات باستخدام جين الأكتين كعنصر تحكم داخلي.

2.4 التكميل الوظيفي لـ PtDGATs في الخميرة التي تعاني من نقص TAG

ستة PtDGAT تم تضخيم الجينات PCR باستخدام cDNA كقالب واستنساخها في ناقل تعبير الخميرة pYES2-CT (Invitrogen) ، باستخدام In Fusion Advantage PCR Cloning Kit (TaKaRa). يتم سرد بادئات PCR للاستنساخ في الجدول S1. تم إدخال كل من البلازميدات المؤتلفة ، بمجرد تأكيدها عن طريق التسلسل ، في سلالة متحولة رباعية ناقصة TAG من H1246 من خميرة الخميرة (Sandager et al. ، 2002). تم استخدام المتجه الفارغ (EV) pYES2-CT كعنصر تحكم سلبي. تمت زراعة محولات الخميرة ، بعد التحقق منها بواسطة Colony PCR ، في وسط SD / -Ura يحتوي على 2 ٪ (وزن / حجم) جالاكتوز للحث على التعبير الجيني. لتجربة الأحماض الدهنية الحرة ، تم تغذية كل من حمض اللينوليك (C18: 2) وحمض ألفا لينولينيك (C18: 3n3) وحمض إيكوسابنتانويك (C20: 5n3) على مزارع الخميرة عند تحريض الجالاكتوز بتركيز 100 ميكرومتر ، كما وصفها ماو وآخرون. (2019). بعد يومين من الزراعة ، تم حصاد مزارع الخميرة لتحليل الدهون وتلطيخ الفلورسنت.

2.5 في الفحص المختبري لـ PtDGATs

تحريض التعبير غير المتجانسة PtDGAT تم إجراء الجينات في H1246 وإعداد الجسيمات الدقيقة من سلالات الخميرة هذه التي تحتوي على PtDGATs وفقًا لإجراءاتنا الموصوفة سابقًا (Liu et al. ، 2017). تم إعادة تعليق كل من الكسور الميكروسومية المحضرة في المخزن المؤقت للتخزين (50 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 10٪ جلسرين) للمقايسة اللاحقة في المختبر.

تم إجراء اختبار DGAT في المختبر في نظام تفاعل 200 ميكرولتر ، والذي يتكون من 20 ميكروغرام بروتين ميكرو ، و 250 ميكرومتر من ركائز أسيل- CoA و DAG ، و 10 ملي مولار MgCl2 في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم (Liu et al. ، 2017). تم استخدام DAG (16: 1/16: 1) كمستقبل أسيل ، بينما تم استخدام 16: 0-CoA و 16: 1-CoA و C20: 5-CoA كمانح أسيل تم شراؤها جميعًا من Larodan Fine Chemicals.

2.6 الإفراط في التعبير عن PtDGATs في P. tricornutum

تسلسل ترميز PtDGAT1, PtDGAT2A عبر PtDGAT2D و PtDGAT3 تم استنساخ كل منها في P. tricornutum ناقل التعبير peGFP (Zhang & Hu ، 2014) ، باستخدام In Fusion Advantage PCR Cloning Kit (TaKaRa). يتم سرد بادئات PCR للاستنساخ في الجدول S1. تحول P. tricornutum عبر Electroporation اتبع بروتوكولاتنا الموصوفة سابقًا (Zhang & Hu ، 2014). تم التحقق من المحولات المفترضة المختارة على وسط صلب F / 2 تحتوي على 75 ميكروغرام / مل زيوسين بواسطة PCR الجيني. بعد ذلك ، تم إجراء qPCR لتحديد مستوى التعبير عن الجينات المحورة في المحولات المحددة. تم اختيار سلالتين مع أعلى مستويات التعبير لكل جين متحور لإجراء مزيد من التجارب.

2.7 التحليلات المجهري الفلوريسنت ومتحد البؤر

لمراقبة الدهون المحايدة في P. tricornutum وخلايا الخميرة ، تم تلطيخها أولاً باستخدام مضان BODIPY ™ 505/515 (Invitrogen) بتركيز عامل 1 ميكروغرام / مل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم تم تصويرها تحت مجهر مضان أوليمبوس BX51 (أوليمبوس) مع الإثارة عند 488 نانومتر والانبعاثات بين 505 و 530 نانومتر. من أجل التوطين الخلوي لـ PtDGATs ، تم تصور سلالات الطحالب المعدلة وراثيًا المقابلة تحت المجهر المتحد البؤر بالليزر Leica TCS SP8. لوحظ تألق GFP مع الإثارة عند 488 نانومتر والانبعاث عند 500-525 نانومتر ، ولوحظ التألق الذاتي للكلوروفيل مع الإثارة عند 488 نانومتر والانبعاث عند 650-750 نانومتر. لمراقبة نواة خلايا الطحالب ، تم تلوينها بـ Hoechst 33342 (Invitrogen) بتركيز 5 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة ثم تصور مع الإثارة عند 405 نانومتر وانبعاث 425-475 نانومتر.

2.8 طرق التحليل

عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيتومتر تحت مجهر ضوئي وتحديد الجاذبية للوزن الجاف لـ P. tricornutum اتبعنا إجراءاتنا الموصوفة سابقًا (Liu et al. ، 2019). أقصى عائد كمي لـ PSII ، Fالخامس/Fم أو FمFا/Fم، على مقياس تألق معدّل بسعة النبضة (PAM) (Water-PAM ، Walz) ، باستخدام خلية طحالب متكيفة مع الظلام لمدة ساعتين (Liu et al. ، 2019): Fا تم تسجيله تحت ضوء ضعيف (& lt10 μmol m −2 s −1 ، وبلغ ذروته عند 650 نانومتر) و Fم كان تحت نبضة مشبعة (0.8 ثانية) من الضوء الأحمر (3000 ميكرولتر م -2 ثانية -1 ، وبلغت ذروتها عند 660 نانومتر). محتوى البروتين في P. tricornutum تم تحديد الخلايا وفقًا لـ Meijer و Wijffels (1998) ، باستخدام عينات طحالب مجففة بالتجميد. محتوى الكربوهيدرات في P. tricornutum تم تحديد الخلايا بطريقة القياس اللوني (Renaud et al. ، 1999) ، بعد التحلل المائي لعينات الطحالب المجففة بالتجميد مع 4 MH2وبالتالي4.

الدهون من الخميرة و P. tricornutum تم استخلاص الخلايا باستخدام الكلوروفورم- ميثانول (2: 1 ، حجم / حجم) كما تم وصفه سابقًا بواسطة Mao et al. (2019). لتحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) ، تم فصل الدهون المستخرجة على صفيحة هلام السيليكا 60 TLC (Merck) باستخدام خليط من الهكسان / ثلاثي بوتيل ميثيل إيثر / حمض الأسيتيك (80/20/2 ، بالحجم) المرحلة المتنقلة (Liu et al. ، 2016). بعد الفصل ، تم تصور TAG على لوحة TLC باستخدام بخار اليود ، وتم استعادته ، وإعادة الأسترة باستخدام 1.5 ٪ من حامض الكبريتيك في ميثانول عند 85 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. إجمالي الدهون من P. tricornutum ومزارع الخميرة ونواتج التفاعل من مقايسات DGAT في المختبر تم تحويلها مباشرة إلى الأسترة.

تم تحليل إسترات ميثيل الأحماض الدهنية المحضرة من الاسترة التبادلية للدهون باستخدام كروماتوجراف الغاز الشعري Agilent 7890 المجهز بكاشف مطياف الكتلة 5975 درجة مئوية وعمود شعري HP-88 (60 م × 0.25 مم تقنيات Agilent) ، باتباع إجراءاتنا الموصوفة سابقًا (ليو وآخرون ، 2016).


الإجراءات التجريبية

المواد النباتية وظروف النمو

النباتات الطافرة والمحورة جينيا من نبات الأرابيدوبسيس (نبات الأرابيدوبسيس thaliana) في الخلفية البرية Col-0. زرعت بذور نبات الأرابيدوبسيس في السماد العضوي ، وطبقت لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية ونمت عند 20 درجة مئوية ، تحت ثاني أكسيد الكربون المحيط.2 (كاليفورنيا. 400 ميكرولتر / مول) ، عند رطوبة نسبية 70٪ وتحت 100 ميكرولتر فوتونات / م 2 / ثانية في دورات مظلمة مدتها 12 ساعة / 12 ساعة ، ما لم يذكر خلاف ذلك.

لتحليل الخطوط المعدلة وراثيا ، تمت مقارنة خطوط الإدراج المتماثلة اللواقح أو خطوط الفصل من النوع البري (T3). في حالة عدم توفر فواصل خارجية من النوع البري ، تمت مقارنة خطوط إدخال متماثلة اللواقح مع نباتات Col-0 من مخزونات البذور من نفس العمر المتولدة في ظل ظروف مماثلة. نباتات التبغ (نيكوتيانا بنتاميانا L.) تحت ظروف منزل زجاجي (بحد أدنى 20 درجة مئوية ، ضوء طبيعي مكمل لإعطاء 12 ساعة على الأقل من الضوء). تم التعبير عن البروتينات الموسومة بالزهرة في سلالة Chlamydomonas من النوع البري cMJ030 (CC-4533) (Zhang وآخرون، 2014). تم الحفاظ على الخلايا في إضاءة منخفضة ثابتة (

10 ميكرومول فوتونات / م 2 / ث) عند درجة حرارة الغرفة على ألواح أجار 1.5٪ (وزن / حجم) تحتوي على Tris-acetate-phosphate (TAP) (Kropat وآخرون. ، 2011). بالنسبة للتصوير ، نمت الخلايا في وسط TAP السائل لتركيز 10 6 خلايا / مل ، محبب بالطرد المركزي (1000) ز، 4 دقائق) ، معلق في وسائط تريس- فوسفات (T-P) الدنيا (Kropat وآخرون. ، 2011) ونمت لمدة 24 ساعة في ثاني أكسيد الكربون المحيط2 قبل التصوير.

الاستنساخ والتعبير عن مكونات CCM في Chlamydomonas

تم التعبير عن إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) لجينات Chlamydomonas في إطار مع Venus من PsaD مروج باستخدام ناقل pLM005. تم تضخيم ORFs من الحمض النووي الجيني باستخدام بوليميراز Phusion Hotstart II (Thermo Fisher Scientific ، www.thermofisher.com) مع oligos ذات الصلة في الجدول S1. تم تنقية منتجات HpaI-cut pLM005 المتجهات ومنتجات PCR وتجميعها بواسطة مجموعة Gibson (Gibson وآخرون، 2009). نظرا لطول الجين الكبير HLA3 ، تم استنساخه في جزأين ثم تم تجميعه في ناقل pLM005 بواسطة مجموعة جيبسون. يحتوي ناقل pLM005 على جين AphVIII لمقاومة الباروموميسين في Chlamydomonas ومقاومة الأمبيسلين لانتقاء البكتيريا. تم التحقق من جميع تقاطعات البناء بواسطة تسلسل Sanger. تم تحويل الإنشاءات إلى Chlamydomonas بواسطة electroporation كما في Zhang وآخرون. (2014). باختصار ، تم تحويل 250 ميكرولتر من 2 × 10 8 خلايا / مل باستخدام 14.5 نانوغرام / كيلو بايت من بلازميد قطع EcoRV عند 16 درجة مئوية. تم نشر الخلايا على 86 مل من لوحات أجار TAP التي تحتوي على الباروموميسين (20 ميكروغرام / مل) وتم الاحتفاظ بها في الإضاءة المنخفضة (

10 ميكرولتر فوتونات / م 2 / ث) حتى أصبحت المستعمرات

قطرها 2-3 مم. تم فحص الألواح بحثًا عن مستعمرات الفلورسنت باستخدام ماسح ضوئي من طراز Typhoon TRIO (GE Healthcare ، www.gelifesciences.com) مع أطوال موجات الإثارة / الانبعاث 532 نانومتر / 520-555 نانومتر للزهرة و 633 نانومتر / 630-670 نانومتر للتألق الذاتي للكلوروفيل.

الاستنساخ والتعبير عن مكونات CCM في التبغ والأرابيدوبسيس

تم استنساخ الجينات من cDNA المشتق من Chlamydomonas (سلالة CC-4886 ، مركز موارد Chlamydomonas). تم تصميم الاشعال من تسلسلات متاحة على Phytozome v10.2 (كلاميدوموناس رينهاردتي v5.5 [Augustus u11.6] ، http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info؟alias=Org_Creinhardtii) (انظر الجدول S1 للحصول على تفاصيل oligo). تسلسل الجينات ل LCIA و HLA3 تم تحسين الكودون للتعبير في النباتات العليا وتوليفها من جديد (DNA2.0 ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) (الشكل S7) ، ثم يتم استنساخها في ناقلات دخول البوابة (مجموعة pCR ® 8 / GW / TOPO ® TA Cloning ®) باستخدام Platinum ® Taq DNA Polymerase عالية الدقة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (Invitrogen ™ Life Technologies ، www.lifetechnologies.com) وتم استنساخها لاحقًا في المتجهات الثنائية الوجهة pK7FWG2،0 (كريمي وآخرون. ، 2002) أو pGWB5 (ناكاجاوا وآخرون، 2009). تم استخدام تجميع Gibson لتوليد اندماج جينات الببتيد العابر. تم تحويل النواقل الثنائية إلى أغروباكتريوم توميفاسيانز (AGL1) للتعبير الجيني العابر في أوراق التبغ (Schöb وآخرون. ، 1997) أو الإدراج المستقر في نباتات Arabidopsis عن طريق غمس الأزهار (Clough and Bent ، 1998). تم إجراء دراسات التعبير المشترك باستخدام متجه WAVE131 لمجموعة علامات "الموجة" (Geldner وآخرون. ، 2009) وناقل mt-rb (Nelson وآخرون. ، 2007) لغشاء البلازما وتوطين الميتوكوندريا ، على التوالي.

استخراج الحمض النووي ، وتحليل PCR والبروتين

لفحص خطوط نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا ، تم استخراج الحمض النووي الجيني من ريدات ناضجة غير مزهرة من نباتات T1 كما هو موصوف في Li and Chory (Li and Chory ، 1998). تم إجراء PCRs كما في McCormick و Kruger (2015). حيثما أمكن ، تم تأكيد موقع إدراج الجينات بواسطة TAIL PCR كما وصفه Liu وآخرون. (1995). تم تحديد خطوط إدخال متجانسة في الجيل T2 إما عن طريق PCR أو عن طريق نسب فصل الشتلات على لوحات Murashige و Skoog (MS) التي تحتوي على الكاناميسين (0.5x).

المستويات النسبية للـ LCIA: GFP و HLA3: تم تأكيد بروتينات GFP في الأوراق بواسطة لطخة مناعية. تم تجزئة ما يقرب من 10 ميكروغرام من البروتين من وريدات عمرها 28 يومًا (100 مجم من الوزن الطازج) بواسطة SDS-PAGE على 10 ٪ (وزن / حجم) أكريلاميد: تم نقل هلام بيساكريلاميد (40: 1) إلى غشاء PVDF ، تم فحصه باستخدام الماوس مكافحة GFP IgG2 أ في 1: 1000 تخفيف (سانتا كروز ، http://www.scbt.com/) وتصور باستخدام HRP الماعز مترافق ضد الفأر IgG2 أ بتخفيف 1:50000. تم الكشف عن نشاط HRP باستخدام Supersignal Ultra (بيرس ، www.piercenet.com) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.

تعبير البويضات ومقايسات امتصاص البيكربونات

تسلسل الجينات المركبة للنضج LCIA (mLCIA) أو HLA3 تم استنساخ عدم وجود كودون توقف في ناقل التعبير Vivid Colors ™ pcDNA ™ 6.2 / EmGFP (Invitrogen ™ Life Technologies) لتوليد اندماج mLCIA- أو HLA3-GFP. بالنسبة إلى LCIA ، تمت إزالة ببتيد تسلسل العبور N-terminal (73 aa) واستبداله بالتسلسل "GACATG" لإضافة تسلسل Kozak وكودون بدء جديد. بالنسبة لـ HLA3 ، تمت إضافة "GAC" على الفور في بداية كودون البدء. لتوليد ناقلات مكافئة تفتقر إلى علامة الفلورسنت ، تم استخدام مجموعة Gibson لإضافة كودون توقف إلى mLCIA أو HLA3 وإزالة تسلسل GFP (720 نقطة أساس). تم تصنيع البلازميدات خطيًا بواسطة AvrII أو StuI (Roche ، www.roche.co.uk) وتم تصنيع mRNA المغطى باستخدام مجموعة نسخ mMESSAGE mMACHINE ® T7 (Ambion ® Life Technologies) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم التعبير عن LCIA الناضج أو HLA3 mRNA في البويضات كما وصفها فنغ وآخرون. (2013). تم حقن بويضات Xenopus بـ 50 nL من mRNA (1 ميكروغرام / ميكرولتر) أو ماء معالج ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) كعنصر تحكم. تم إجراء فحوصات امتصاص بيكربونات والتصوير متحد البؤر 3 د بعد الحقن في بروتوكول مقتبس من Mariscal وآخرون. (2006). تم تحضين البويضات في وسط MBS جديد (88 م كلوريد الصوديوم ، 1 م م بوكل ، 2.4 م م ناهكو3، 0.71 م كاكل2، 0.82 م م MgSO4 و 15 م HEPES ، درجة الحموضة 7.4) ، تحتوي على 0.12 م م NaHCO3 (1.85 جيجا بايت / مول NaH 14 CO3). بعد 10 دقائق ، تم غسل البويضات ثلاث مرات باستخدام MBS المثلج وتم فصلها في 200 ميكرولتر من SDS (10٪ [وزن / حجم]) ، وتم قياس النشاط الإشعاعي المحتفظ به في البويضات الفردية.

تقدير كمية الكلوروفيل

تم استخلاص الكلوروفيل من أقراص الأوراق المجففة في الجليد البارد 80٪ (حجم / حجم) أسيتون و 10 م م تريس-حمض الهيدروكلوريك ، وتم قياس التركيز وفقًا لـ Porra وآخرون. ( 1989 ).

قياس معلمات التمثيل الضوئي

تم تحديد معدلات تبادل الغازات باستخدام محلل غاز الأشعة تحت الحمراء المحمول LI-6400 (LI-COR Biosciences ، //www.licor.com/) إما على الورقة السادسة أو السابعة من 35- إلى 45-d من العمر الناضج وغير المزهر. نمت الورود في أواني كبيرة لتوليد مساحة أوراق كافية لقياسات تبادل الغازات (Flexas وآخرون. ، 2007). استجابة صافي ثاني أكسيد الكربون الناتج عن التمثيل الضوئي2 الاستيعاب (أ) إلى ثاني أكسيد الكربون تحت العضلي2 تركيز (جأنا) عن طريق تغيير ثاني أكسيد الكربون الخارجي2 تركيز من 0 إلى 1000 ميكرولتر / مول تحت إشعاع ضوئي نشط ثابت من 1500 ميكرولتر فوتونات / م 2 / ثانية (يتم توفيرها بواسطة مصدر ضوء أحمر-أزرق متصل بغرفة الورقة). تم تصحيح بيانات تبادل الغاز لثاني أكسيد الكربون2 الانتشار كما في Bellasio وآخرون. (2015). تم الحفاظ على درجة حرارة الورقة والرطوبة النسبية للغرفة عند 21 درجة مئوية و 70٪ على التوالي. لحساب الحد الأقصى لمعدل الكربوكسيل (الخامسج ، كحد أقصى) ، أقصى تدفق لنقل الإلكترون (يالأعلى) والتوصيل الوسطي (زم) ، تم تركيب بيانات A / Ci على C3 نموذج التمثيل الضوئي (Farquhar وآخرون. ، 1980) مع تعديلات لتشمل تقديرات ل زم كما وصفها Ethier and Livingston (2004).

المسح المجهري بالليزر متحد البؤر

تم استخدام مجهر مسح ضوئي بالليزر Leica TCS SP2 (Leica Microsystems) مع عدسة موضوعية مغمورة بالماء (HCX IRAPO 25.0x0.95) لتصوير الأوراق والبويضات. كانت أطوال موجات الإثارة / الانبعاث 488 نانومتر / 500-530 نانومتر لـ GFP ، 543 نانومتر / 590-620 نانومتر لـ mCherry و 488 نانومتر / 680-750 نانومتر للتألق الذاتي للكلوروفيل. تم الحصول على الصور باستخدام برنامج Leica LAS AF (http://www.leica-microsystems.com/). قبل تصوير البروتينات الموسومة بالزهرة في Chlamydomonas ، تمت إضافة 15 ميكرولتر من الخلايا إلى بئر من لوحة بصرية 96 بئر (Brooks Life Science Systems ، //www.brooks.com) ومغطاة بـ 150 ميكرولتر من 1.5 ٪ نقطة انصهار منخفضة [اغروس) تحتوي على TP (

35 درجة مئوية). لتلوين الميتوكوندريا ، CCP1: Venus- و CCP2: نمت خطوط التعبير عن الزهرة في وسط سائل T-P مع الباروموميسين (2 ميكروغرام / مل) بتركيز 2-4 × 10 6 خلايا / مل. تم تحضين الثقافات باستخدام MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher Scientific) إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر لمدة 10 دقائق ، ثم تم رصدها على شريحة مغلفة بالبوليسين للتصوير. تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر مخصص (Leica DMI6000) مع إعدادات عند 514 نانومتر / 532-555 نانومتر للزهرة ، 561 نانومتر / 573-637 نانومتر للتلوين بواسطة Mitotracker Red CMXRos و 561 نانومتر / 665-705 نانومتر للتألق الذاتي للكلوروفيل . تم تحليل الصور باستخدام برنامج فيجي (http://fiji.sc/Fiji).

تحليل احصائي

تم تقييم الاختلافات في الاستجابة بين الأنماط الجينية إما عن طريق تحليل التباين (ANOVA) أو تحليل الطالب ر- الاختبارات التي يتبعها اختبار Tukey للفرق الكبير الصادق (HSD) اللاحق (SPSS Statistics 18، http://www.ibm.com/). الاختلافات التي ص & lt 0.05 تعتبر كبيرة.


مراجع

بوك ، ر. (محرر) البيولوجيا الخلوية والجزيئية للبلاستيدات (Springer-Verlag Berlin ، هايدلبرغ ، 2007).

Gray، M.W. أصل وتطور جينومات العضية. بالعملة. رأي. جينيه. ديف. 3, 884–890 (1993).

Zoschke، R. & amp Bock، R. ترجمة الكلوروبلاست: التنظيم الهيكلي والوظيفي والتحكم التشغيلي والتنظيم. الخلية النباتية 30, 745–770 (2018).

باركان ، أ.تعبير الجينات البلاستيد: توضيحات خاصة بالعضوية على سقالة بدائية النواة. نبات فيزيول. 155, 1520–1532 (2011).

Woodson، J.D & amp Chory، J. تنسيق التعبير الجيني بين الجينوم العضوي والنووي. نات. القس جينيه. 9, 383–395 (2008).

Choquet ، Y. & amp Wollman ، F. A. in كلاميدوموناس كتاب مرجعي الطبعة الثانية (محرران EH Harris وآخرون) 1027-1064 (Academic Press ، Oxford ، 2009).

نيكلسن ، ج. ، بون ، أ. & amp Westhoff ، P. in علم الأحياء البلاستيد. التقدم في بيولوجيا النبات (محرران S. Theg & amp F.A. Wollman) Chloroplast Gene Expression - Translation (Springer، New York، NY، 2014).

يكشف Brar، G.A & amp Weissman، J. S. Ribosome Profiling عن ماذا ومتى وأين وكيف يتم تخليق البروتين. نات. القس مول. خلية بيول. 16, 651–664 (2015).

Ingolia، N. T.، Ghaemmaghami، S.، Newman، J.R & amp Weissman، J. S. التحليل على مستوى الجينوم في الجسم الحي للترجمة مع دقة النيوكليوتيدات باستخدام التنميط الريبوسوم. علم 324, 218–223 (2009).

Zoschke, R., Watkins, K. P. & Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. الخلية النباتية 25, 2265–2275 (2013).

Chotewutmontri, P. & Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. بلوس جينيت. 12, e1006106 (2016).

Zoschke, R. & Barkan, A. Genome-wide analysis of thylakoid-bound ribosomes in maize reveals principles of cotranslational targeting to the thylakoid membrane. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 112, E1678–1687 (2015).

Lukoszek, R., Feist, P. & Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of نبات الأرابيدوبسيس thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. بيول مصنع بيول. 16, 221 (2016).

Gawronski, P., Jensen, P. E., Karpinski, S., Leister, D. & Scharff, L. B. Plastid ribosome pausing is induced by multiple features and is linked to protein complex assembly. نبات فيزيول. 176, 2557–2569 (2018).

Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. نات. القس جينيه. 15, 205–213 (2014).

Schwarz, C., Elles, I., Kortmann, J., Piotrowski, M. & Nickelsen, J. Synthesis of the D2 protein of photosystem II in كلاميدوموناس is controlled by a high molecular mass complex containing the RNA stabilization factor Nac2 and the translational activator RBP40. الخلية النباتية 19, 3627–3639 (2007).

Nickelsen, J., Fleischmann, M., Boudreau, E., Rahire, M. & Rochaix, J. D. Identification of رابطة الدول المستقلة-acting RNA leader elements required for chloroplast psbD التعبير الجيني في كلاميدوموناس. الخلية النباتية 11, 957–970 (1999).

Boudreau, E., Nickelsen, J., Lemaire, S. D., Ossenbühl, F. & Rochaix, J. D. The Nac2 جين كلاميدوموناس encodes a chloroplast TPR-like protein involved in psbD mRNA stability. Embo J. 19, 3366–3376 (2000).

Klinkert, B., Elles, I. & Nickelsen, J. Translation of chloroplast psbD mRNA in كلاميدوموناس is controlled by a secondary RNA structure blocking the AUG start codon. الدقة الأحماض النووية. 34, 386–394 (2006).

Rott, M. et al. ATP synthase repression in tobacco restricts photosynthetic electron transport, CO2 assimilation, and plant growth by overacidification of the thylakoid lumen. الخلية النباتية 23, 304–321 (2011).

Berry, J. O., Mure, C. M. & Yerramsetty, P. Regulation of Rubisco gene expression in C4 plants. بالعملة. رأي. مصنع بيول. 31, 23–28 (2016).

Kovtun, Y. & Daie, J. End-product control of carbon metabolism in culture-grown sugar beet plants (molecular and physiological evidence on accelerated leaf development and enhanced gene expression). نبات فيزيول. 108, 1647–1656 (1995).

Zoschke, R., Qu, Y., Zubo, Y. O., Börner, T. & Schmitz-Linneweber, C. Mutation of the pentatricopeptide repeat-SMR protein SVR7 impairs accumulation and translation of chloroplast ATP synthase subunits in نبات الأرابيدوبسيس thaliana. J. Plant Res. 126, 403–414 (2013).

Grahl, S. et al. ال أرابيدوبسيس protein CGLD11 is required for chloroplast ATP synthase accumulation. مول. مصنع 9, 885–899 (2016).

Eberhard, S., Drapier, D. & Wollman, F. A. Searching limiting steps in the expression of chloroplast-encoded proteins: Relations between gene copy number, transcription, transcript abundance and translation rate in the chloroplast of كلاميدوموناس رينهاردتي. مصنع J. 31, 149–160 (2002).

Cavaiuolo, M., Kuras, R., Wollman, F. A., Choquet, Y. & Vallon, O. Small RNA profiling in كلاميدوموناس: Insights into chloroplast RNA metabolism. الدقة الأحماض النووية. 45, 10783–10799 (2017).

Maul, J. E. et al. ال كلاميدوموناس رينهاردتي plastid chromosome: Islands of genes in a sea of repeats. الخلية النباتية 14, 2659–2679 (2002).

Sato, S., Nakamura, Y., Kaneko, T., Asamizu, E. & Tabata, S. Complete structure of the chloroplast genome of نبات الأرابيدوبسيس thaliana. الدقة DNA. 6, 283–290 (1999).

Shinozaki, K. et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: Its gene organization and expression. EMBO J. 5, 2043–2049 (1986).

Ueda, M. et al. Substitution of the gene for chloroplast RPS16 was assisted by generation of a dual targeting signal. مول. بيول. Evol. 25, 1566–1575 (2008).

Schwenkert, S. et al. PsbI affects the stability, function, and phosphorylation patterns of photosystem II assemblies in tobacco. J. بيول. تشيم. 281, 34227–34238 (2006).

Swiatek, M. et al. The chloroplast gene ycf9 encodes a photosystem II (PSII) core subunit, PsbZ, that participates in PSII supramolecular architecture. الخلية النباتية 13, 1347–1367 (2001).

Umate, P. et al. Deletion of PsbM in tobacco alters the QB site properties and the electron flow within photosystem II. J. بيول. تشيم. 282, 9758–9767 (2007).

Finazzi, G., Drapier, D. & Rappaport, F. in The Chlamydomonas Sourcebook 2nd edn (eds E.H. Harris et al.) 639–670 (Academic Press, Oxford, 2009).

Seelert, H., Dencher, N. A. & Müller, D. J. Fourteen protomers compose the oligomer III of the proton-rotor in spinach chloroplast ATP synthase. جيه مول. بيول. 333, 337–344 (2003).

Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C. & Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. زنزانة 157, 624–635 (2014).

Ikemura, T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. مول. بيول. Evol. 2, 13–34 (1985).

Sugiura, M. Plastid mRNA translation. طرق مول. بيول. 1132, 73–91 (2014).

Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D. & Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. زنزانة 165, 976–989 (2016).

Minai, L., Wostrikoff, K., Wollman, F. A. & Choquet, Y. Chloroplast biogenesis of photosystem II cores involves a series of assembly-controlled steps that regulate translation. الخلية النباتية 18, 159–175 (2006).

Loizeau, K. et al. Small RNAs reveal two target sites of the RNA-maturation factor Mbb1 in the chloroplast of كلاميدوموناس. الدقة الأحماض النووية. 42, 3286–3297 (2014).

Vaistij, F. E., Goldschmidt-Clermont, M., Wostrikoff, K. & Rochaix, J. D. Stability determinants in the chloroplast psbB/T/H mRNAs of كلاميدوموناس رينهاردتي. مصنع J. 21, 469–482 (2000).

Levey, T., Westhoff, P. & Meierhoff, K. Expression of a nuclear-encoded psbH gene complements the plastidic RNA processing defect in the PSII mutant hcf107 في نبات الأرابيدوبسيس thaliana. مصنع J. 80, 292–304 (2014).

Komenda, J. et al. Accumulation of the D2 protein is a key regulatory step for assembly of the photosystem II reaction center complex in متزامن PCC 6803. J. بيول. تشيم. 279, 48620–48629 (2004).

Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M. & Ikeuchi, M. PSII-Tc protein plays an important role in dimerization of photosystem II. فيسيول الخلية النباتية. 45, 1809–1816 (2004).

Liu, X. Q., Xu, H. & Huang, C. Chloroplast chlB gene is required for light-independent chlorophyll accumulation in كلاميدوموناس رينهاردتي. مصنع مول. بيول. 23, 297–308 (1993).

Ramundo, S., Rahire, M., Schaad, O. & Rochaix, J. D. Repression of essential chloroplast genes reveals new signaling pathways and regulatory feedback loops in كلاميدوموناس. الخلية النباتية 25, 167–186 (2013).

Sun, Y. & Zerges, W. Translational regulation in chloroplasts for development and homeostasis. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1847, 809–820 (2015).

Börner, T., Aleynikova, A. Y., Zubo, Y. O. & Kusnetsov, V. V. Chloroplast RNA polymerases: Role in chloroplast biogenesis. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1847, 761–769 (2015).

Barkan, A. & Small, I. Pentatricopeptide repeat proteins in plants. Annu. القس بيول النبات. 65, 415–442 (2014).

Hammani, K. et al. Helical repeats modular proteins are major players for organelle gene expression. بيوكيمي 100, 141–150 (2014).

Idoine, A. D., Boulouis, A., Rupprecht, J. & Bock, R. The diurnal logic of the expression of the chloroplast genome in كلاميدوموناس رينهاردتي. بلوس واحد 9, e108760 (2014).

Nakamura, Y., Gojobori, T. & Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. الدقة الأحماض النووية 28, 292 (2000).

Morton, B. R. Chloroplast DNA codon use: Evidence for selection at the psbA locus based on tRNA availability. جيه مول. Evol. 37, 273–280 (1993).

Morton, B. R. & Levin, J. A. The atypical codon usage of the plant psbA gene may be the remnant of an ancestral bias. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 94, 11434–11438 (1997).

Nixon, P. J., Michoux, F., Yu, J., Boehm, M. & Komenda, J. Recent advances in understanding the assembly and repair of photosystem II. آن. بوت. 106, 1–16 (2010).

Hirose, T. & Sugiura, M. Multiple elements required for translation of plastid atpB mRNA lacking the Shine–Dalgarno sequence. الدقة الأحماض النووية. 32, 3503–3510 (2004).

Kuroda, H. et al. Translation of psbC mRNAs starts from the downstream GUG, not the upstream AUG, and requires the extended Shine–Dalgarno sequence in tobacco chloroplasts. فيسيول الخلية النباتية. 48, 1374–1378 (2007).

Scharff, L. B. et al. Shine-Dalgarno sequences play an essential role in the translation of plastid mRNAs in tobacco. الخلية النباتية 29, 3085–3101 (2017).

Nakamura, M. & Sugiura, M. Translation efficiencies of synonymous codons are not always correlated with codon usage in tobacco chloroplasts. مصنع J. 49, 128–134 (2007).

Nakamura, M. & Sugiura, M. Translation efficiencies of synonymous codons for arginine differ dramatically and are not correlated with codon usage in chloroplasts. الجين 472, 50–54 (2011).

Li, G. W., Oh, E. & Weissman, J. S. The anti-Shine–Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. طبيعة سجية 484, 538–541 (2012).

Pechmann, S. & Frydman, J. Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding. نات. هيكل. مول. بيول. 20, 237–243 (2013).

Schroda, M., Vallon, O., Wollman, F. A. & Beck, C. F. A chloroplast-targeted heat shock protein 70 (HSP70) contributes to the photoprotection and repair of photosystem II during and after photoinhibition. الخلية النباتية 11, 1165–1178 (1999).

Harris, E. H., Boynton, J. E. & Gillham, N. W. Chloroplast ribosome biogenesis in كلاميدوموناس. Selection and characterization of mutants blocked in ribosome formation. J. خلية بيول. 63, 160–179 (1974).

Mettler, T. et al. Systems analysis of the response of photosynthesis, metabolism, and growth to an increase in irradiance in the photosynthetic model organism كلاميدوموناس رينهاردتي. الخلية النباتية 26, 2310–2350 (2014).

Sharp, P. M. & Li, W. H. The codon Adaptation Index—A measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. الدقة الأحماض النووية. 15, 1281–1295 (1987).

Puigbo, P., Bravo, I. G. & Garcia-Vallve, S. E-CAI: A novel server to estimate an expected value of Codon Adaptation Index (eCAI). BMC Bioinforma. 9, 65 (2008).

Willmund, F. & Schroda, M. HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in كلاميدوموناس رينهاردتي. نبات فيزيول. 138, 2310–2322 (2005).

Liu, C. et al. J-domain protein CDJ2 and HSP70B are a plastidic chaperone pair that interacts with vesicle-inducing protein in plastids 1. مول. بيول. زنزانة 16, 1165–1177 (2005).


الاستنتاجات

Here, we identified 92 COMT genes from blueberry and 425 COMT genes from 15 other species. According to phylogenetic analysis of COMTs, we divided the COMTs into two groups, which indicated the existence of two ancestor genes. DSD and WGD were revealed to be the major forces of blueberry evolution. The Ka/Ks ratios of the gene duplication patterns for the COMTs from the four plant species were less than 1, indicating that the COMTs have experienced strong purifying selection. According to the qRT-PCR results for 22 VcCOMTs, VcCOMT40, VcCOMT92 were highly expressed and may play important roles in the synthesis of lignin of blueberry fruit. The results of this study will build foundations for breeding blueberry cultivars with higher fruit firmness and longer shelf life.


We acknowledge funding of this research project by the Research Council of Norway (RCN) and the University of Hamburg (Hamburg, Germany). We are grateful to Prof. C. Benning (Michigan State University, East Lansing, United States) for providing the expression vector pNoc ox Venus. We also would like to thank Elke Wölken (Department of Aquatic Ecophysiology and Phycology, University of Hamburg) for analyses of immunogold-labeled N. oceanica transformants by transmission electron microscopy.

aa, amino acid ALNS, allantoin synthase ASW, artificial sea water At, نبات الأرابيدوبسيس thaliana CaMV, cauliflower mosaic virus DC, decarboxylase DECR, 2,4-dienoyl-CoA reductase DHNS, 1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase dpt, days post transformation EMB8, embryogenesis-associated protein 8 EPA, eicosapentaenoic acid EYFP/GFP, enhanced yellow/green fluorescent protein HIT, histidine triad family protein HIUase, 5-hydroxyisourate hydrolase IndA, indigoidine synthase A MDH, malate dehydrogenase MLS, malate synthase Ng, Nannochloropsis gaditana OHCU, 2-oxo-4-hydroxy-4-carboxy-5-ureidoimidazoline PEX, peroxin PfkB, 6-phosphofructokinase PGL3, 6-phosphogluconolactonase 3 PKT, peroxisomal 3-ketoacyl thiolase PTS1/2, peroxisomal targeting signal type 1/2 PUFA, polyunsaturated fatty acid PUKI, pseudouridine kinase PUMY, pseudouridine monophosphate glycosylase TEM, transmission electron microscopy.


نتائج

Proteome profile changes in P. patens under ABA treatment

Changes in the proteome profile between control and ABA treated plants suggested that exogenous ABA could trigger one or more responses in P. patens. In order to ensure statistically results, the experiments were carried out in triplicate. After CBB R-250 staining, more than 1,300 protein spots could be detected for each sample. Representative gels from control and ABA-treated plants and proteins showing altered abundance are presented in Figure ​ Figure1. 1. Two-dimensional images were analyzed using ImageMaster™ 2D Platinum software. The volume percentage of each spot was estimated and compared across the gels. In the samples following ABA treatment, we repeatedly analyzed 89 protein spots, whose relative abundance was at least 1.5-fold different from the control. The proteins associated with 65 of these protein spots were subsequently identified using LC-MS/MS. Among them, 13 protein spots (D1-D13) were down-regulated, 52 protein spots (U1-U52) were up-regulated by ABA treatment including four protein spots (U22, U24, U40, U43) which were only present in the ABA-treated samples (Figure ​ (Figure1). 1 ). Quantitative analysis indicated that the abundance of these proteins changed [see Additional File 1: Supplemental Table S1] in response to ABA treatment (Figure ​ (Figure2) 2 ) suggesting that different physiological and biochemical processes are modified following ABA treatment.


شاهد الفيديو: Media1 mp4تركيب الشكل الخضري +الاسس العامة للطحالب (يوليو 2022).


تعليقات:

  1. Arabei

    يبدو لي أنك على حق

  2. Akinoshakar

    أشك في ذلك.

  3. Jarel

    لاحظ المؤلف كل شيء على نحو ملائم للغاية

  4. Samujora

    هل تفهمنى؟

  5. Fabian

    موضوع لا تضاهى ، بالنسبة لي هو)))) مثيرة للاهتمام

  6. Dolius

    لا ، على العكس.



اكتب رسالة