معلومة

عكس النسخ PCR الأمثل

عكس النسخ PCR الأمثل



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هي الكمية المثالية من الحمض النووي الريبي لاستخدامها في RT؟ وكم [كدنا] لاستخدامها بعد ذلك ل PCR؟

لقد قمت بعمل RT بمحلول RNA قدره 0.36 ميكروغرام / ماي. ثم بالنسبة لـ PCR الخاص بي ، استخدمت 1 ul من cDNA التي تم الحصول عليها واستخدمت 25 دورة لأنني كنت آمل أن أرى فرقًا بين المستوى الداخلي والتعبير الزائد. ومع ذلك ، لم أكتشف أي نطاق بالارتفاع المتوقع 500 نقطة أساس لكن نطاقًا منتشرًا عند 100 نقطة أساس. ما الذي يمكن أن تمثله 100 نقطة أساس؟ التمهيدي ديمر؟ لقد تحولت إلى 35 دورة واستخدمت نفس الكمية من cDNA أو أضفت 3 مرات أكثر من cDNA. في كلتا الحالتين ، حصلت على نطاقات بالارتفاع المتوقع (لكنها أقوى عندما أضع المزيد من cDNA) ولا تزال فرقًا كبيرة عند 100 نقطة أساس.


أرى فرقًا ضبابية كبيرة حول 100 نقطة أساس أيضًا. هم على الأرجح تلوث الحمض النووي الريبي. للتخلص منها ، هضم منتجات RT-PCR الخاصة بك باستخدام RNAse-H. ولكن إذا كنت تحتاج فقط إلى تصور الفرقة التي تهتم بها ، ولم تكن العصابات الضبابية تعترض طريقك ، فلا ينبغي أن تكون هذه مشكلة.

عادةً ما أدخل في أي مكان من 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في تفاعل RT-PCR الخاص بي باستخدام مجموعة Invitrogen Superscript III لحجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر. بعد التفاعل ، أستخدم 1/10 من حجم ذلك (2 ميكرولتر) لتطبيقات المصب (PCR). هذا عادة ما يعطيني نتائج جيدة.

لتحسين RT-PCR لاكتشاف هدف معين ، ضع في اعتبارك استخدام بادئات محددة للجينات (تأكد من استخدام البادئات المضادة للحواس فقط) في RT-PCR بدلاً من oligo-dT أو hexamers العشوائية. هذا يثري هدفك عند استخدامها لتطبيقات المصب. عند استخدام نظام الأفضليات المعمم ، تأكد من إجراء تفاعل موازٍ مع بادئات التحكم (أي بيتا أكتين) لإثبات أن تفاعل RT-PCR يعمل.


لا توجد "كمية مثالية" واحدة من الحمض النووي الريبي. أود أن أقترح عليك عمل منحنى معايرة لتحديد أفضل مبلغ للمقايسة المحددة الخاصة بك. يمكن أن يكون النطاق عند 100 نقطة أساس تضخيمًا غير محدد. يمكنك محاولة زيادة درجة حرارة التلدين قليلاً لمعرفة ما إذا كان ذلك يزيل (أو يقلل) النطاق السفلي. بدلاً من ذلك ، يمكنك التفكير في مجموعة مختلفة من البرايمر أو حتى PCR متداخلة. أيضًا ، لا يزال من الممكن أن تنظر إلى بديل الربط في تلك الفرقة. هل يمتد التمهيدي الخاص بك على أكثر من إكسون واحد؟


تصميم وتحسين نسخة عكسية جديدة من تفاعل البوليميراز المتسلسل الخطي بعد الأسي للكشف عن فيروس مرض الحمى القلاعية

الأهداف: تم تطوير اختبار جزيئي جديد للكشف عن فيروس مرض الحمى القلاعية (FMDV) باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل الخطي بعد الأسي (LATE-PCR).

الطرق والنتائج: أظهرت التجارب التجريبية باستخدام أهداف الحمض النووي الاصطناعية قدرة LATE-PCR على تحديد تركيز الهدف الأولي من خلال اكتشاف نقطة النهاية. ثم تم استخدام بروتوكول من خطوتين يتضمن النسخ العكسي (RT) متبوعًا بـ LATE-PCR لتأكيد قدرة الفحص على اكتشاف FMDV RNA. أخيرًا ، تم دمج RT و LATE-PCR في اختبار مزدوج من خطوة واحدة من أجل التضخيم المشترك لقطاع FMDV RNA وضبط داخلي يتكون من RNA مدرع. في هذا الشكل ، يتم تهجين كل من البادئات الزائدة في خليط التفاعل مع أهداف الحمض النووي الريبي الخاصة بهم خلال فترة حضانة قصيرة قبل الحضانة ، ثم تولد خيوط كدنا خلال خطوة RT مدتها 3 دقائق عند 60 درجة مئوية ، ويتم تضخيم cDNA الناتج بواسطة LATE -PCR دون التدخل في معالجة العينات.

الاستنتاجات: يولد اختبار RT-LATE-PCR إشارات الفلورسنت عند نقطة النهاية التي تتناسب مع عدد البداية لأهداف RNA ويمكنها اكتشاف مجموعة من متغيرات التسلسل باستخدام مسبار واحد غير متطابق.

أهمية الدراسة وتأثيرها: بالإضافة إلى تقديم تحسينات على فحوصات التشخيص الجزيئي الحالية المعتمدة على المختبر لفيروس FMDV ، فإن هذا الاختبار الجديد متوافق مع جهاز محمول جديد ("نقطة رعاية") ، وهو BioSeeq II ، المصمم للتشخيص السريع لمرض الحمى القلاعية في هذا المجال. .

© 2009 المؤلفون. تجميع المجلة © 2009 جمعية علم الأحياء الدقيقة التطبيقي.


محتويات

تم وصف تقنية RT-PCR و qPCR المدمجة على أنها RT-PCR الكمية [3] أو RT-PCR في الوقت الحقيقي [4] (تسمى أحيانًا RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي [5]) ، وقد تم اختصارها بشكل مختلف على النحو التالي qRT-PCR [6] RT-qPCR [7] RRT-PCR [8] و rRT-PCR. [9] لتجنب الالتباس ، سيتم استخدام الاختصارات التالية باستمرار في هذه المقالة:

تقنية اختصار
تفاعل البلمرة المتسلسل PCR
النسخ العكسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل RT-PCR
تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي qPCR
تقنية RT-PCR / qPCR المدمجة qRT-PCR

لا يستخدم جميع المؤلفين ، وخاصة المؤلفين الأقدم منهم ، هذه الاتفاقية ويجب على القارئ توخي الحذر عند اتباع الروابط. تم استخدام RT-PCR للإشارة إلى كل من PCR في الوقت الفعلي (qPCR) والنسخ العكسي PCR (RT-PCR).

منذ تقديمه في عام 1977 ، تم استخدام اللطخة الشمالية على نطاق واسع لتقدير الحمض النووي الريبي على الرغم من أوجه القصور فيه: (أ) تقنية تستغرق وقتًا طويلاً ، (ب) تتطلب كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي للكشف ، و (ج) غير دقيقة من الناحية الكمية في الوفرة المنخفضة من محتوى الحمض النووي الريبي. [10] [11] ومع ذلك ، منذ اختراعه بواسطة Kary Mullis في عام 1983 ، قام RT PCR منذ ذلك الحين بإزاحة اللطخة الشمالية كطريقة مفضلة لاكتشاف الحمض النووي الريبي وتقديره. [12]

ارتفع RT-PCR ليصبح التكنولوجيا المعيارية لاكتشاف و / أو مقارنة مستويات الحمض النووي الريبي لعدة أسباب: (أ) لا يتطلب معالجة ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، (ب) نطاق واسع (& gt10 7 أضعاف) وفرة الحمض النووي الريبي يمكن قياسها ، و (ج) أنها توفر نظرة ثاقبة لكل من البيانات النوعية والكمية. [5] نظرًا لبساطته وخصوصياته وحساسيته ، يتم استخدام RT-PCR في مجموعة واسعة من التطبيقات بدءًا من التجارب البسيطة مثل القياس الكمي لخلايا الخميرة في النبيذ إلى الاستخدامات الأكثر تعقيدًا كأدوات تشخيص للكشف عن العوامل المعدية مثل إنفلونزا الطيور فيروس و SARS-CoV-2. [13] [14] [15]

في RT-PCR ، يتم تحويل قالب RNA أولاً إلى DNA تكميلي (cDNA) باستخدام النسخ العكسي (RT). ثم يتم استخدام (كدنا) كقالب للتضخيم الأسي باستخدام PCR. أحدث استخدام RT-PCR للكشف عن نسخة RNA ثورة في دراسة التعبير الجيني بالطرق المهمة التالية:

  • جعل من الممكن نظريًا اكتشاف نصوص أي جين عمليًا [16]
  • تم تمكين تضخيم العينة وإلغاء الحاجة إلى مواد البداية الوفيرة المطلوبة عند استخدام تحليل اللطخة الشمالية [17] [18]
  • توفير التسامح لتحلل الحمض النووي الريبي طالما أن الحمض النووي الريبي الممتد على التمهيدي سليم [17]

خطوة واحدة RT-PCR مقابل خطوتين RT-PCR Edit

يمكن تحقيق القياس الكمي لـ mRNA باستخدام RT-PCR كخطوة واحدة أو تفاعل من خطوتين. يكمن الاختلاف بين الطريقتين في عدد الأنابيب المستخدمة عند تنفيذ الإجراء. يتطلب التفاعل المكون من خطوتين إجراء تفاعل النسخ العكسي وتضخيم PCR في أنابيب منفصلة. عيب النهج المكون من خطوتين هو القابلية للتلوث بسبب التعامل مع العينات بشكل متكرر. [19] من ناحية أخرى ، فإن التفاعل الكامل من تخليق (كدنا) إلى تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل يحدث في أنبوب واحد في نهج الخطوة الواحدة. يُعتقد أن نهج الخطوة الواحدة يقلل التباين التجريبي من خلال احتواء جميع التفاعلات الأنزيمية في بيئة واحدة. إنه يلغي خطوات أنابيب منتج (كدنا) ، الذي يتطلب عمالة مكثفة وعرضة للتلوث ، لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). الاستخدام الإضافي للبوليميرات المقاومة للمثبطات ، محسنات البوليميراز مع حالة RT-PCR محسّنة من خطوة واحدة ، تدعم النسخ العكسي للحمض النووي الريبي من عينات غير منقاة أو خام ، مثل الدم الكامل والمصل. [20] [21] ومع ذلك ، فإن قوالب RNA البادئة معرضة للتدهور في نهج الخطوة الواحدة ، ولا يوصى باستخدام هذا النهج عند الحاجة إلى إجراء فحوصات متكررة من نفس العينة. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن نهج الخطوة الواحدة أقل دقة مقارنة بالنهج المكون من خطوتين. إنها أيضًا الطريقة المفضلة للتحليل عند استخدام أصباغ ربط الحمض النووي مثل SYBR Green حيث يمكن تحقيق التخلص من الثنائيات الأولية من خلال تغيير بسيط في درجة حرارة الانصهار. ومع ذلك ، فإن نهج الخطوة الواحدة هو حل مناسب نسبيًا للكشف السريع عن الحمض النووي الريبي المستهدف مباشرة في التحسس الحيوي. [ بحاجة لمصدر ]

نقطة النهاية RT-PCR مقابل تحرير RT-PCR في الوقت الفعلي

يمكن تقسيم القياس الكمي لمنتجات RT-PCR إلى فئتين: نقطة النهاية والوقت الفعلي. [22] يُفضل استخدام نقطة النهاية RT-PCR لقياس تغيرات التعبير الجيني في عدد صغير من العينات ، لكن RT-PCR في الوقت الفعلي أصبح الأسلوب القياسي الذهبي للتحقق من صحة النتائج الكمية التي تم الحصول عليها من تحليلات المصفوفة أو التعبير الجيني التغييرات على نطاق عالمي. [23]

تحرير نقطة النهاية RT-PCR

تتطلب مناهج القياس لنقطة النهاية RT-PCR الكشف عن مستويات التعبير الجيني عن طريق استخدام الأصباغ الفلورية مثل بروميد الإيثيديوم ، [24] [25] وسم P32 لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الفسفور ، [26] أو عن طريق حساب التلألؤ. [18] يتحقق تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) للنقطة النهائية باستخدام ثلاث طرق مختلفة: نسبي وتنافسي ومقارنة. [27] [28]

تتضمن الكميات النسبية RT-PCR النسبية لـ RT-PCR التضخيم المشترك للتحكم الداخلي في وقت واحد مع الجين المعني. يستخدم التحكم الداخلي لتطبيع العينات. بمجرد التطبيع ، يمكن إجراء مقارنة مباشرة لوفرة النسخ النسبية عبر عينات متعددة من mRNA. أحد الاحتياطات التي يجب ملاحظتها هو أنه يجب اختيار الضوابط الداخلية بحيث لا تتأثر بالمعالجة التجريبية. يجب أن يكون مستوى التعبير ثابتًا عبر جميع العينات ومع mRNA ذي الأهمية حتى تكون النتائج دقيقة وذات مغزى. نظرًا لأنه يتم تحليل التقدير الكمي للنتائج من خلال مقارنة النطاق الخطي للهدف وتضخيم التحكم ، فمن الأهمية بمكان مراعاة تركيز جزيئات البداية المستهدفة ومعدل تضخيمها قبل بدء التحليل. يتم التعبير عن نتائج التحليل كنسب إشارة الجينات إلى إشارة التحكم الداخلي ، والتي يمكن بعد ذلك استخدام القيم للمقارنة بين العينات في تقدير التعبير النسبي للحمض النووي الريبي المستهدف. [25] [28] [29] يتم استخدام تقنية RT-PCR التنافسية RT-PCR من أجل القياس الكمي المطلق. وهو ينطوي على استخدام RNA اصطناعي "منافس" يمكن تمييزه عن RNA الهدف من خلال اختلاف بسيط في الحجم أو التسلسل. من المهم أن يكون تصميم الحمض النووي الريبي الاصطناعي متطابقًا في التسلسل ولكن أقصر قليلاً من الحمض النووي الريبي المستهدف للحصول على نتائج دقيقة. بمجرد التصميم والتركيب ، تتم إضافة كمية معروفة من RNA المنافس إلى العينات التجريبية ويتم تضخيمها مع الهدف باستخدام RT-PCR. بعد ذلك ، يتم إنتاج منحنى تركيز الحمض النووي الريبي المنافس ويتم استخدامه لمقارنة إشارات RT-PCR الناتجة من النصوص الداخلية لتحديد مقدار الهدف الموجود في العينة. [28] [30] يشبه RT-PCR المقارن RT-PCR التنافسي RT-PCR من حيث أن RNA المستهدف يتنافس على كواشف التضخيم ضمن تفاعل واحد مع معيار داخلي من التسلسل غير ذي الصلة. بمجرد اكتمال التفاعل ، تتم مقارنة النتائج بمنحنى قياسي خارجي لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي المستهدف. بالمقارنة مع طرق القياس الكمي النسبية والتنافسية ، يعتبر RT-PCR المقارن الطريقة الأكثر ملاءمة للاستخدام نظرًا لأنه لا يتطلب من المحقق إجراء تجربة تجريبية في RT-PCR النسبي ، يجب أن يكون نطاق التضخيم الأسي لـ mRNA أن تكون محددة سلفًا وفي RT-PCR تنافسية ، يجب تصنيع RNA منافس اصطناعي. [28] [31] [32] [33] [34]

تحرير RT-PCR في الوقت الحقيقي

أدى ظهور تقنيات وسم الحمض النووي الفلوري في السنوات القليلة الماضية إلى تمكين تحليل واكتشاف منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، وبالتالي أدى إلى اعتماد واسع النطاق لـ RT-PCR في الوقت الحقيقي لتحليل التعبير الجيني. ليس فقط RT-PCR في الوقت الحقيقي هو الأسلوب المفضل لتقدير التعبير الجيني ، بل هو أيضًا الطريقة المفضلة للحصول على نتائج من تحليلات المصفوفة والتعبيرات الجينية على نطاق عالمي. حاليًا ، هناك أربعة مجسات مختلفة من الحمض النووي الفلوري متاحة للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل RT-PCR في الوقت الحقيقي لمنتجات PCR: SYBR Green و TaqMan والمنارات الجزيئية ومسبارات العقرب. تسمح كل هذه المجسات باكتشاف منتجات PCR عن طريق توليد إشارة فلورية. بينما تبعث صبغة SYBR Green إشارة الفلورسنت الخاصة بها ببساطة عن طريق الارتباط بالحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في المحلول ، فإن توليد مجسات TaqMan والمنارات الجزيئية والعقارب من التألق يعتمد على Förster Resonance Energy Transfer (FRET) اقتران جزيء الصبغة و جزء تقضي على ركائز قليل النوكليوتيد. [35]

SYBR Green عندما يرتبط SYBR Green بالحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل لمنتجات PCR ، فإنه ينبعث منه الضوء عند الإثارة. تزداد شدة التألق مع تراكم منتجات PCR. هذه التقنية سهلة الاستخدام لأن تصميم المجسات ليس ضروريًا نظرًا لعدم وجود خصوصية ربطها. ومع ذلك ، نظرًا لأن الصبغة لا تميز الحمض النووي مزدوج الشريطة من منتجات PCR وتلك الموجودة في الثنائيات الأولية ، فإن المبالغة في تقدير التركيز المستهدف هي مشكلة شائعة. عندما يكون التحديد الكمي الدقيق ضرورة مطلقة ، يجب إجراء مزيد من الفحص للتحقق من صحة النتائج. ومع ذلك ، من بين طرق اكتشاف منتجات RT-PCR في الوقت الفعلي ، يعد SYBR Green هو الأكثر اقتصادا وأسهل استخدامًا. [22] [23]

يتم استخدام استراتيجيتين بشكل شائع لتقدير النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة RT-PCR في الوقت الفعلي بطريقة المنحنى القياسي وطريقة العتبة المقارنة. [40]

يوفر التضخيم الأسي عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي تقنية عالية الحساسية يمكن من خلالها اكتشاف عدد نسخ منخفض جدًا من جزيئات الحمض النووي الريبي. يستخدم RT-PCR على نطاق واسع في تشخيص الأمراض الوراثية ، وبشكل دلالي ، في تحديد وفرة جزيئات مختلفة من الحمض النووي الريبي داخل الخلية أو الأنسجة كمقياس للتعبير الجيني.

طرق البحث تحرير

يشيع استخدام RT-PCR في طرق البحث لقياس التعبير الجيني. على سبيل المثال ، Lin et al. تستخدم qRT-PCR لقياس التعبير عن جينات Gal في خلايا الخميرة. أولاً ، لين وآخرون. مهندس طفرة في بروتين يشتبه في مشاركته في تنظيم جينات Gal. تم افتراض أن هذه الطفرة تلغي بشكل انتقائي تعبير جال. لتأكيد ذلك ، تم تحليل مستويات التعبير الجيني لخلايا الخميرة التي تحتوي على هذه الطفرة باستخدام qRT-PCR. تمكن الباحثون من تحديد أن طفرة هذا البروتين التنظيمي قللت من تعبير Gal. [41] يستخدم تحليل اللطخة الشمالية لدراسة التعبير الجيني للحمض النووي الريبي بشكل أكبر.

تحرير إدخال الجينات

يمكن أن يكون RT-PCR مفيدًا جدًا أيضًا في إدخال جينات حقيقية النواة في بدائيات النوى. نظرًا لأن معظم الجينات حقيقية النواة تحتوي على إنترونات ، والتي توجد في الجينوم ولكن ليس في mRNA الناضج ، فإن cDNA الناتج عن تفاعل RT-PCR هو تسلسل الحمض النووي الدقيق (بغض النظر عن الطبيعة المعرضة للخطأ في النسخ العكسية). تترجم مباشرة إلى بروتين بعد النسخ. عندما يتم التعبير عن هذه الجينات في خلايا بدائية النواة من أجل إنتاج البروتين أو تنقيته ، فإن الحمض النووي الريبي المنتج مباشرة من النسخ لا يحتاج إلى التضفير لأن النسخة تحتوي على exons فقط. (تفتقر بدائيات النوى ، مثل الإشريكية القولونية ، إلى آلية ربط الرنا المرسال في حقيقيات النوى).

تعديل تشخيص الأمراض الوراثية

يمكن استخدام RT-PCR لتشخيص الأمراض الوراثية مثل متلازمة ليش نيهان. ينتج هذا المرض الوراثي عن خلل في الجين HPRT1 ، مما يؤدي سريريًا إلى حصوات البول المميتة لحمض البوليك وأعراض مشابهة لمرض النقرس. [6] [ التوضيح المطلوب ] تحليل الأم الحامل والجنين لمستويات تعبير الرنا المرسال لـ HPRT1 سيكشف ما إذا كانت الأم حاملة للجنين وما إذا كان من المحتمل أن يصاب الجنين بمتلازمة ليش نيهان. [42]

تحرير الكشف عن السرطان

يعمل العلماء على طرق لاستخدام RT-PCR في اكتشاف السرطان للمساعدة في تحسين التشخيص ومراقبة الاستجابة للعلاج. تنتج الخلايا السرطانية المنتشرة نسخًا فريدة من الرنا المرسال اعتمادًا على نوع السرطان. الهدف هو تحديد نسخ mRNA التي تعمل كأفضل العلامات الحيوية لنوع معين من الخلايا السرطانية ثم تحليل مستويات التعبير باستخدام RT-PCR. [43]

يستخدم RT-PCR بشكل شائع في دراسة جينومات الفيروسات التي تتكون جينوماتها من RNA ، مثل Influenzavirus A ، والفيروسات القهقرية مثل HIV و SARS-CoV-2. [44]

على الرغم من مزاياها الرئيسية ، إلا أن RT-PCR لا يخلو من العيوب. ينتج عن النمو الأسي للحمض النووي التكميلي المنسوخ العكسي (cDNA) خلال الدورات المتعددة لـ PCR تقديرًا كميًا غير دقيق لنقطة النهاية بسبب صعوبة الحفاظ على الخطية. [45] من أجل توفير الكشف الدقيق والقياس الكمي لمحتوى الحمض النووي الريبي في العينة ، تم تطوير qRT-PCR باستخدام تعديل قائم على التألق لمراقبة منتجات التضخيم خلال كل دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن أن تكون الحساسية الشديدة لهذه التقنية بمثابة سيف ذو حدين لأن أدنى تلوث للحمض النووي يمكن أن يؤدي إلى نتائج غير مرغوب فيها. [46] تتمثل إحدى الطرق البسيطة للتخلص من النتائج الإيجابية الخاطئة في تضمين المراسي ، أو العلامات ، إلى المنطقة 5 'من مادة التمهيدي المحددة للجين. [47] بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يمثل تخطيط وتصميم دراسات القياس الكمي تحديًا تقنيًا نظرًا لوجود العديد من مصادر الاختلاف بما في ذلك تركيز القالب وكفاءة التضخيم. [31] زيادة كمية معروفة من الحمض النووي الريبي في عينة ، وإضافة سلسلة من تخفيفات الحمض النووي الريبي لتوليد منحنى معياري ، وإضافة عينة بدون قالب نسخة (لا يوجد كدنا) يمكن استخدامها كعناصر تحكم.

يمكن تنفيذ RT-PCR بواسطة بروتوكول RT-PCR بخطوة واحدة أو بروتوكول RT-PCR المكون من خطوتين.

تحرير RT-PCR بخطوة واحدة

أهداف mRNA (حتى 6 كيلو بايت) لعكس النسخ متبوعًا بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في أنبوب اختبار واحد. من المهم أن نلاحظ أن استخدام الحمض النووي الريبي السليم وعالي الجودة والبادئة الخاصة بالتسلسل سيؤدي إلى أفضل النتائج.

بمجرد اختيار مجموعة RT-PCR ذات الخطوة الواحدة مع مزيج من النسخ العكسي ، وبوليميراز DNA Taq ، وبوليميراز التدقيق اللغوي ويتم الحصول على جميع المواد والمعدات اللازمة ، يتم تحضير مزيج تفاعل. يشتمل مزيج التفاعل على dNTPs ، والبادئات ، والحمض النووي الريبي القالب ، والإنزيمات الضرورية ، ومحلول عازلة. يضاف خليط التفاعل إلى أنبوب PCR لكل تفاعل ، متبوعًا بقالب RNA. ثم يتم وضع أنابيب PCR في دائري حراري لبدء الدورة. في الدورة الأولى ، يحدث تخليق (كدنا). الدورة الثانية هي التمسخ الأولي حيث يتم تعطيل إنزيم النسخ العكسي. الدورات 40-50 المتبقية هي التضخيم ، والذي يتضمن التمسخ ، التلدين ، والاستطالة. عند اكتمال التضخيم ، يمكن تحليل منتجات RT-PCR باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. [48] ​​[49]

(دليل تطبيقات PCR والأدوات الحيوية)

تحرير RT-PCR بخطوتين

يحدث RT-PCR من خطوتين ، كما يوحي الاسم ، في خطوتين. أولا النسخ العكسي ثم PCR. هذه الطريقة أكثر حساسية من طريقة الخطوة الواحدة. المجموعات مفيدة أيضًا لـ RT-PCR من خطوتين. تمامًا كما هو الحال مع PCR بخطوة واحدة ، استخدم فقط الحمض النووي الريبي السليم والعالي الجودة للحصول على أفضل النتائج. لا يجب أن يكون التمهيدي لـ PCR المكون من خطوتين محددًا بالتسلسل.

الخطوة الأولى تحرير

قم أولاً بدمج الحمض النووي الريبي (RNA) والقالب التمهيدي ومزيج dNTP والمياه الخالية من نوكلياز في أنبوب PCR. ثم أضف مثبط RNase ونسخة عكسية إلى أنبوب PCR. بعد ذلك ، ضع أنبوب PCR في دائري حراري لدورة واحدة فيها

يحدث التلدين والتمديد والتعطيل للنسخة العكسية. أخيرًا ، انتقل مباشرةً إلى الخطوة الثانية وهي تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تخزين المنتج على الجليد حتى يمكن تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل.

الخطوة الثانية تحرير

إضافة مزيج رئيسي يحتوي على المخزن المؤقت ، مزيج dNTP ، MgCl2و Taq polymerase والمياه الخالية من نوكلياز لكل أنبوب PCR. ثم أضف التمهيدي اللازم للأنابيب. بعد ذلك ، ضع أنابيب PCR في دورة حرارية لمدة 30 دورة من برنامج التضخيم. وهذا يشمل: التمسخ ، التلدين ، والاستطالة. يمكن تحليل منتجات RT-PCR بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. [50]

يعتبر اختبار RT-PCR الكمي هو المعيار الذهبي لقياس عدد نسخ أهداف معينة (كدنا) في عينة ولكنها غير موحدة بشكل جيد. [51] نتيجة لذلك ، في حين أن هناك العديد من المنشورات التي تستخدم هذه التقنية ، فإن العديد منها يقدم تفاصيل تجريبية غير كافية ويستخدم تحليل بيانات غير مناسب لاستخلاص استنتاجات غير ملائمة. نظرًا للتنوع المتأصل في جودة أي بيانات كمية PCR ، لا يواجه المراجعون صعوبة في تقييم هذه المخطوطات فحسب ، بل أصبح من المستحيل أيضًا تكرار الدراسات. [52] إدراكًا للحاجة إلى توحيد معايير الإبلاغ عن الظروف التجريبية ، تم نشر الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب PCR الكمية في الوقت الحقيقي (MIQE ، وضوحا mykee) من قبل اتحاد دولي من العلماء الأكاديميين. تصف إرشادات MIQE الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لتقييم تجارب PCR الكمية التي يجب أن تكون مطلوبة للنشر لتشجيع ممارسة تجريبية أفضل وضمان ملاءمة ودقة وتفسير صحيح وتكرار لبيانات PCR الكمية. [53]

إلى جانب إرشادات الإبلاغ ، يشدد MIQE على الحاجة إلى توحيد التسميات المرتبطة بـ PCR الكمي لتجنب الارتباك على سبيل المثال ، يجب استخدام الاختصار qPCR من أجل PCR في الوقت الحقيقي الكمي ويجب استخدام RT-qPCR للنسخ العكسي- qPCR، ويجب الإشارة إلى الجينات المستخدمة للتطبيع على أنها جينات مرجعية بدلاً من جينات التدبير المنزلي. يقترح أيضًا أنه لا ينبغي استخدام المصطلحات المشتقة تجاريًا مثل تحقيقات TaqMan ولكن بدلاً من ذلك يشار إليها باسم تحقيقات التحلل المائي. بالإضافة إلى ذلك ، يُقترح استخدام دورة القياس الكمي (Cq) لوصف دورة PCR المستخدمة للتقدير الكمي بدلاً من دورة العتبة (Ct) ونقطة العبور (Cp) ونقطة الإقلاع (TOP) ، والتي تشير إلى نفس القيمة ولكنها كانت كذلك صاغها مصنعون مختلفون لأدوات الوقت الحقيقي. [51]

يتكون المبدأ التوجيهي من العناصر التالية: 1) التصميم التجريبي ، 2) العينة ، 3) استخراج الحمض النووي ، 4) النسخ العكسي ، 5) معلومات الهدف qPCR ، 6) قليل النوكليوتيدات ، 7) البروتوكول ، 8) التحقق من الصحة ، و 9) البيانات التحليلات. تحمل العناصر المحددة داخل كل عنصر تسمية إما E (أساسي) أو D (مرغوب فيه). تعتبر تلك المصنفة E حرجة ولا غنى عنها بينما تعتبر تلك المسمى D هامشية ولكنها مهمة لأفضل الممارسات. [53]


تحسين النسخ العكسي الكمي PCR للتحقق من بيانات ميكروأري (كدنا)

تحليل ميكروأري (كدنا) مفيد للغاية لرصد التغيرات على مستوى الجينوم في التعبير الجيني التي تحدث في العمليات البيولوجية. تتطلب المعايير الحالية أن يتم التحقق من ملاحظات المصفوفات الدقيقة بواسطة (Q) -PCR الكمية أو تقنيات أخرى. قامت دراسات قليلة بتحسين Q-PCR للتحقق من نتائج ميكروأري. قيمت الدراسة الحالية العديد من المتغيرات التي تؤثر على دقة Q-PCR ، بما في ذلك طرق استخراج الحمض النووي الريبي ، وإثراء الرنا المرسال ، والبادئات للنسخ العكسي ، وطرق الكشف عن تضخيم (كدنا). تم تقييم أيضًا اختيار الجين المرجعي الذي تستند إليه تغييرات التعبير الجيني الأخرى. تم العثور على الحمض النووي الريبي للبروتين الريبوزومي S28 ليكون مثاليا لهذا الغرض ، مع الحد الأدنى من التباين في التعبير بين خطوط الخلايا متساوية المنشأ المقاومة للأدوية. وجدنا أيضًا أن بادئات oligo (dT) كانت متفوقة على السداسيات العشوائية وأن الحمض النووي الريبي المستخرج بطريقة RNeasy أعطى تضخيمًا ثابتًا للجين S28 دون الحاجة إلى تخصيب mRNA ، خاصة عند استخدام تحقيقات TaqMan. ومع ذلك ، كانت الحساسية عالية بدرجة كافية مع SYBR Green I لدرجة أنها كانت الطريقة المفضلة والأقل تكلفة لاكتشاف منتجات التضخيم ، حتى بالنسبة للنسخ منخفضة الوفرة. باستخدام الطريقة المثلى ، يمكن تأكيد 91-95 ٪ من الاختلافات في التعبير الجيني المحدد بين خطوط الخلايا بواسطة تحليل ميكروأري (كدنا) بواسطة Q-PCR ، متفوقة بشكل كبير على الطرق الموصوفة سابقًا.


تحسين PCR الخاص بك

يمكن أن يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل أحيانًا تحسين ظروف التفاعل من أجل الحصول على نتيجة ناجحة. تعرف على كيفية تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجاربك باستخدام الأسئلة الشائعة أدناه.

عند تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ما هي الشروط ذات الأهمية الخاصة؟

خطوة التمسخ الأولي

أحيانًا يكون التسخين المسبق مطلوبًا لإفساد القوالب المعقدة (على سبيل المثال ، الحمض النووي الجيني) 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة كافية للتمسخ. قد تؤدي المعالجة الحرارية المفرطة إلى تعطيل الإنزيم.

  • بالنسبة لـ Terra PCR Direct Polymerase Mix ، والذي يستخدم لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من الأنسجة دون استخراج الحمض النووي وتنقيته ، يلزم التسخين المسبق عند 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  • لتاكارا لا طق بوليميرات الحمض النووي وبوليميرات الحمض النووي GC2 ميزة ، مطلوب خطوة تمسخ أولية.
  • لا تتطلب إنزيمات PrimeSTAR التسخين المسبق لتنشيط الإنزيم.

شروط تغيير الطبيعة

يجب اختيار شروط تغيير الطبيعة من خلال النظر في نموذج التدوير الحراري الذي سيتم استخدامه. المبدأ التوجيهي العام هو 94 & ndash95 & degC لمدة 30 ثانية أو 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوانٍ.

إذا كنت تستخدم إنزيمًا مقاومًا للحرارة ، مثل أحد بوليميرات PrimeSTAR ، فإننا نوصي بخطوة تمسخ لمدة قصيرة ودرجة حرارة عالية (على سبيل المثال ، 5 و ndash10 ثوانٍ عند 98 درجة مئوية).

قد يؤدي التمسخ عند درجة حرارة عالية جدًا أو لفترة طويلة جدًا إلى فقدان نشاط الإنزيم و / أو تلف القوالب الطويلة.

شروط التلدين

يجب ضبط خطوة التلدين لكل مجموعة أساس ، وتعتمد درجة حرارة التلدين مباشرة على Tم من الاشعال. قد يؤدي استخدام درجات حرارة التلدين المنخفضة جدًا إلى تضخيم خاطئ وغير محدد ، مما يؤدي إلى عوائد منخفضة للمنتج المطلوب.

يمكن تحسين كفاءة وخصوصية التضخيم عن طريق تعديل درجة حرارة التلدين وفقًا لطبقة التمهيدي T.م أو عن طريق تنفيذ PCR من خطوتين.

  • ل طق الإنزيمات ، وقت التلدين الموصى به هو 30 ثانية.
  • تتمتع الإنزيمات الموجودة في سلسلة PrimeSTAR بكفاءة تحضير ممتازة. لذلك ، من المهم استخدام وقت التلدين القصير 5 & ndash15 ثانية. قد تؤدي أوقات التلدين الطويلة للغاية إلى تضخيم غير محدد ناتج عن الخطأ.
  • عند تضخيم التسلسلات القصيرة التي يقل حجمها عن 1 كيلو بايت ، يوصى باستخدام بروتوكول PCR ثلاثي الخطوات. بالنسبة للأهداف الغنية بالـ GC أو تضخيم التسلسلات الطويلة (& gt10 كيلو بايت) ، يوصى باستخدام بروتوكول PCR من خطوتين.

خطوة التمديد

بشكل عام ، يوصى بوقت تمديد قدره 1 دقيقة / كيلو بايت. عند استخدام الإنزيمات عالية السرعة SpeedSTAR HS DNA Polymerase أو SapphireAmp Fast PCR Master Mix ، استخدم معدل تفاعل 10 ثوانٍ / كيلو بايت من المنتج المضخم (على سبيل المثال ، 10 ثوانٍ لمنتج 1 كيلوبايت ، 20 ثانية لمنتج 2 كيلوبايت ، إلخ.).

يحتوي PrimeSTAR Max DNA Polymerase و PrimeSTAR GXL DNA Polymerase على عامل استطالة خاص ويسمح بالتفاعلات عالية السرعة عند 5 & ndash20 ثانية / كيلو بايت. في حالة استخدام هذه الإنزيمات مع عينات تحتوي على قالب زائد ، يجب استخدام وقت استطالة يبلغ 1 دقيقة / كيلو بايت.

هل يجب أن أستخدم بروتوكول PCR من ثلاث خطوات أم خطوتين؟

يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المكون من ثلاث خطوات خطوات التمسخ والتليين والتمديد. يجب استخدام هذا النوع من البروتوكول عندما يكون حرف T.م من البادئات أقل من درجة حرارة الامتداد أو أقل من 68 درجة مئوية.

إذا كانت درجة حرارة انصهار التمهيدي (T.م) قريبة من درجة حرارة الامتداد (72 درجة مئوية) أو أقل ببضع درجات ، ضع في اعتبارك استخدام بروتوكول PCR المكون من خطوتين والذي يتضمن خطوة تمسخ وخطوة تلدين / تمديد مجمعة. مع هذا البروتوكول ، يجب ألا تتجاوز درجة حرارة التلدين درجة حرارة التمديد.

ما درجة حرارة الامتداد التي يجب أن أستخدمها ، 68 درجة مئوية أو 72 درجة مئوية؟

يفضل تمديد درجة حرارة 68 درجة مئوية لـ PCR من خطوتين وعند تضخيم القوالب الأطول (& gt4 كيلو بايت). تعمل درجة حرارة الامتداد المنخفضة هذه على تحسين إنتاجية منتجات التضخيم الأطول بشكل كبير عن طريق تقليل معدل التنقية الذي يؤثر على التضخيم.

يجب استخدام 72 درجة مئوية كدرجة حرارة تمديد عند إجراء PCR قياسي من ثلاث خطوات ولتضخيم الأجزاء القصيرة (& lt4 kb).

ما هي الكمية المثلى من قالب الحمض النووي التي يجب استخدامها في تفاعل البوليميراز المتسلسل؟

يعتمد المقدار الأمثل للقالب المطلوب على مدى تعقيد القالب ورقم نسخة التسلسل المستهدف. ما يقرب من 10 4 نسخ من تسلسل الحمض النووي الهدف مطلوبة للكشف عن منتج التضخيم في 25 & ndash30 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

  • عادةً ما يحتوي 1 & microg من الحمض النووي البشري الجينومي على 3.04 × 10 5 جزيئات من الحمض النووي. بالنسبة لمعظم تطبيقات PCR ، يكفي 30 & ndash100 نانوغرام من الحمض النووي الجيني البشري. تتطلب الأهداف عالية النسخ ، مثل جينات التدبير المنزلي ، 10 نانوغرام فقط من القالب. تتراوح مقادير القوالب للقوالب عالية التعقيد بين 10 نانوغرام و 500 نانوغرام.
  • عادة ، 1 ميكروغرام من بكتريا قولونية يحتوي الحمض النووي الجينومي على 2 × 10 8 جزيئات من الحمض النووي ، وبالتالي ، فإن الكمية الموصى بها للقالب تتراوح بين 100 بيكوغرام و 1 نانوغرام.
  • نموذجيًا ، يحتوي 1 & microg من DNA lambda على 1.9 × 10 10 جزيئات من الحمض النووي ، وبالتالي ، يمكن أن يكون إدخال القالب أقل من 100 بيكوغرام.
  • يعتمد مقدار قالب (كدنا) على رقم نسخة الهدف. عادة ما يتم وصف مدخلات (كدنا) من حيث مدخلات الرنا المكافئة. يمكن أن تكون كمية (كدنا) في تفاعل PCR أقل من 10 بيكوغرام (مكافئ الحمض النووي الريبي).

من المهم ملاحظة أنه لا يمكن لجميع البوليمرات تحمل كميات زائدة من القالب. بالنسبة للعينات التي تحتوي على قالب زائد (حتى 1 ومايكروغ) ، نوصي PrimeSTAR GXL DNA Polymerase.

ما هي العوامل الحاسمة لتضخيم الأهداف الجينومية طويلة؟

جودة القالب

سلامة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لتضخيم الأهداف الطويلة. تلف الحمض النووي و mdashs ، مثل كسر الحمض النووي أثناء عزل الحمض النووي أو تنقية الحمض النووي في درجات حرارة مرتفعة وانخفاض درجة الحموضة ونتائج mdashs في كمية أكبر من المنتجات الجزئية وانخفاض العائد الكلي. يمكن أن يحدث تلف الحمض النووي أيضًا في الظروف الحمضية ، لذلك تجنب استخدام الماء لإعادة تعليق قوالب الحمض النووي. يكون الحمض النووي أكثر استقرارًا عند درجة الحموضة 7 و ndash8 أو في المحاليل المخزنة.

شروط PCR

  • يجب الحفاظ على وقت التمسخ إلى الحد الأدنى لتقليل أحداث التنقية.
  • استخدم بدء PCR عند درجة حرارة تلدين أعلى وخفض بمقدار درجتين لكل دورة لعدة دورات.
  • تصميم البادئات بدرجات حرارة انصهار (T.م) فوق 68 درجة مئوية.

بوليميرات PCR

نحن نقدم العديد من بوليمرات PCR المحسّنة من أجل PCR بعيد المدى. تاكارا لا طق بوليميراز الحمض النووي ، TaKaRa LA Taq يوصى بالبوليميراز مع GC Buffer و PrimeSTAR GXL DNA Polymerase اعتمادًا على محتوى GC وحجم الهدف (الأهداف).

كيف يمكنني تحديد ما إذا كان القالب غنيًا بـ GC؟

تختلف نسبة GC عبر الجينوم. تعتبر القوالب ذات المحتوى & gt65٪ GC غنية بـ GC. تتركز مناطق الجينوم الغنية بالـ GC في الغالب في المناطق التنظيمية ، بما في ذلك المروجين والمعززات والعناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة. تميل المسالك الغنية بالـ GC إلى تكوين تكرارات مقلوبة ، أو هياكل دبوس الشعر ، والتي قد لا تذوب أثناء خطوة التلدين في تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك ، يتم إعاقة تضخيم القوالب الغنية بالـ GC عن طريق الفصل غير الفعال بين خيوط الحمض النووي. ينتج عن هذا أمبليكون مقطوع بسبب الإنهاء المبكر لتمديد البوليميراز.

ما هي العوامل الحاسمة لتضخيم النماذج الغنية بالـ GC؟

شروط PCR

  • استخدم درجات حرارة تمسخ أعلى (على سبيل المثال ، 98 درجة مئوية بدلاً من 94 درجة مئوية أو 95 درجة مئوية) للسماح بتمسخ كامل للقالب.
  • حافظ على أوقات التلدين للقوالب الغنية بالـ GC في أقصر وقت ممكن.
  • Use primers with a higher Tم (>68°C), because annealing can occur at a higher temperature.

PCR polymerases

Use a polymerase optimized for amplification of GC-rich sequences. To find an enzyme, visit our selection guide.

Can DMSO be added to improve amplification of GC-rich templates?

We have heard from customers that improved amplification of GC-rich templates was obtained by adding DMSO to reactions using PrimeSTAR MAX DNA Polymerase or CloneAmp HiFi PCR Premix. The recommended concentration of DMSO is between 2.5% and 5%.

How can I optimize PCR conditions for AT-rich templates?

Some templates may have long AT-rich stretches that are hard to amplify under standard reaction conditions. ال المتصورة المنجلية genome is about 80% AT, and regions flanking genes are often AT rich.

Polymerases recommended for GC-rich templates, such as EmeraldAmp GT PCR Master Mix, EmeraldAmp Max PCR master mixes, and PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, are also suitable for AT-rich templates.

The advantage of having AT-rich templates is that a lower extension temperature can be used. For certain templates with AT content >80&ndash85%, the extension temperature can be lowered from 72°C to 65&ndash60°C. DNA replication at this reduced temperature appears to be reliable (Su et al. 1996).

مراجع

Su, X. Z., وآخرون. Reduced Extension Temperatures Required for PCR Amplification of Extremely A+T-rich DNA. Nucl Acids Res. 24, 1574&ndash1575 (1996).

What is the role of magnesium in PCR, and what is the optimal concentration?

Magnesium is a required cofactor for thermostable DNA polymerases and is important for successful amplification. Without adequate free Mg 2+ , PCR polymerases are not active. In contrast, excess free Mg 2+ reduces enzyme fidelity and may increase nonspecific amplification. A number of factors can affect the amount of free Mg 2+ in a reaction, including DNA template concentration, chelating agents in the sample (e.g., EDTA or citrate), dNTP concentration, and the presence of proteins.

  • Some polymerases (e.g., Takara Ex Taq DNA polymerases and Takara LA Taq DNA polymerases) are supplied with a magnesium-free reaction buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2. For these enzymes, you can optimize the Mg 2+ concentration for each reaction. and Advantage 2 DNA polymerases are magnesium-tolerant polymerases that are supplied with buffers containing 3.5 mM of MgCl2.
  • The final concentration of Mg 2+ for PrimeSTAR GXL DNA Polymerase and PrimeSTAR MAX DNA Polymerase reactions is 1 mM this concentration increases fidelity for these enzymes.

What is the role of salt in PCR reactions?

Successful PCR requires that the DNA duplex separates during the denaturation step and that primers anneal to the denatured DNA. Salt neutralizes the negative charges on the phosphate backbone of DNA, stabilizing double-stranded DNA by offsetting negative charges that would otherwise repel one another. Potassium chloride (KCl) is normally used in PCR amplifications at a final concentration of 50 mM. To improve amplification of DNA fragments, especially fragments between 100 and 1,000 bp, a KCl concentration of 70&ndash100 mM is recommended. For amplification of longer products, a lower salt concentration appears to be more effective, whereas amplification of shorter products occurs optimally with higher salt concentrations. This effect is likely because high salt concentration preferentially permits denaturation of short DNA molecules over long DNA molecules.

It is important to note that a salt concentration above 50 mM can inhibit طق بوليميراز.

Takara Bio USA, Inc.
United States/Canada: +1.800.662.2566 &bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 &bull Europe: +33.(0)1.3904.6880 &bull Japan: +81.(0)77.565.6999
FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. © 2021 Takara Bio Inc. All Rights Reserved. All trademarks are the property of Takara Bio Inc. or its affiliate(s) in the U.S. and/or other countries or their respective owners. Certain trademarks may not be registered in all jurisdictions. Additional product, intellectual property, and restricted use information is available at takarabio.com.

Takara Bio Europe is a member of the Takara Bio Group, a leading life sciences company that is committed to improving the human condition through biotechnology. Through our Takara, Clontech, and Cellartis brands, our mission is to develop high-quality innovative tools and services to accelerate discovery.


Process:

  • Sample preparation
  • Selection of primers
  • Reaction preparation
  • RT-PCR cyclic condition
  • Strand synthesis

Sample preparation:

Instead of DNA, RNA is extracted for the RT-PCR. For extracting the RNA use ready to use RNA extraction kits, it performs better and the yield of the extraction is even good.

We have to extract RNA, not DNA. Care must be taken while extraction as RNase present on every possible surface in a lab. RNase is an enzyme cleaves RNA. Here we are extracting total RNA, not mRNA for gene expression study.

Use ready to use RNA extraction kit to avoid problems in extraction. So use total RNA instead of the only mRNA.

Selection of primers:

1. Random primers:

Random primers are short single-stranded sequences of hexamers or octamers. The random primer binds at the complementary random location on the RNA. It can bind to many types of RNA (tRNA, rRNA or mRNA) and synthesizes the cDNA.

It is used in the RT-PCR particularly for the templates having a huge secondary structure. Random hexamer provides high yield cDNA. However, it can produce truncated cDNA.

The randoms primers work finely for prokaryotic DNA, rRNA, rRNA, and other smaller RNAs. But as it can’t bind to poly-A tail, it is less preferred for eukaryotic RNA amplification.

Smaller fragments of RNA can be easily amplified using randoms primers. 2 to 5 μM concentration of random primers is enough for RT-PCR. Higher concentration can make the reaction ineffective. The hexamer bindings on RNA are shown into the figure below.

2.Oligo (dT) primers:

The oligo (dT) primers are specially designed to amplify the mRNA. As we know that the mRNA has a poly-A tail, the oligo (dT) primers only bind to the poly-A tail of mRNA. Hence it is used to amplify entire mDNA into cDNA. It can even amplify smaller mRNAs as well.

The oligo (dT) primers are 12 to 18 nucleotide long single-stranded DNA which contains one additional nucleotide at the 3′ end to anchor the binding. The anchored (dT) primers prevent the primer slippage and primer denaturation from the poly-A tail.

However, the oligo (dT) primers can not synthesize RNA other than mRNA because the tRNAs, rRNAs, and micro RNA do not have the poly-A tail. 2 to 4 μM concentration of oligo (dT) primers are enough for RT-PCR, usually.

oligo (dT) primer binding on the template mRNA is shown into the figure below,

3.Sequence-specific primers:

The sequence-specific primers are commonly utilized in one-step RT-PCR to amplify a gene of interest. The sequences in the sequence-specific primers are complementary to the sequence of our interest therefore, it can’t amplify other gene regions.

Furthermore, it can only amplify a specific region, a large amount of primary template is need to perform RT-PCR using this type of primers. Due to its high sequence specificity, it is preferred more in gene expression studies.

The sequence-specific primers synthesize only certain regions from the RNA, therefore less amount is recommended to achieve success in the reaction. 0.5 to 1.5 μM concentration is enough for the RT-qPCR.

ملحوظة: If sequence-specific primers and oligo (dT) primers both are used in a single reaction, use the only 1μM each primer.

The figure above shows the specificity of the sequence-specific primers, as it can only bind to the mRNA and cannot binds to gDNA.


Chemical and Synthetic Biology Approaches To Understand Cellular Functions - Part A

Justin M. Thomas , . Jordan L. Meier , in Methods in Enzymology , 2019

2.3.2 Reverse transcription of borohydride-treated RNA

Reverse transcription of sodium borohydride-treated ac4c results in partial incorporation of adenosine in the cDNA strand opposite the reduced ac4C. It should also be noted that reduced ac4C results in partial termination of reverse transcription at or adjacent to its location, often referred to as RT-stops ( Fig. 4 A). Of the reverse transcriptase enzymes screened by our lab TGIRT-III RT (Ingex) produces the highest proportion of full-length to stop product, as well as the most robust C-to-T signature of the RT enzymes screened by our lab ( Fig. 4 B). The following protocol describes the use of TGIRT RT for sequence-defined cDNA generation, which we have used to profile ac4C in model substrates and human 18S rRNA ( Thomas et al., 2018 ).

Dilute RNA from Section 2.2.2 to 100 pg/μL in water for use as template.

Perform TGIRT RT reactions. We typically carry out RT in 20 μL volumes in PCR tubes. Exemplary protocol: combine 4 μL 5 × TGIRT reaction buffer with 200 pg (2 μL) of template, 4 pM DNA primer, 2 μL 50 mM MgCl2 and sufficient ultra-pure water to bring the mixture to 17 μL. Note 1: TGIRT reactions are incubated at 57 °C, higher than many other commercially available reverse transcription enzymes. Therefore, it is essential to design the reverse transcription primer to form a stable duplex with the target sequence at this temperature. Note 2: Fluorophore or radiolabeled primers can be substituted at this step to assess RT stop via primer extension assay ( Fig. 4 )

Heat to 75 °C for 3 min and placed on ice for 1 min to anneal the primer and RNA.

After cooling, add 0.5 μL TGIRT-III, 0.5 μL Rnasin Plus and 100 μL 100 mM DTT. Incubate 20 min at room temperature. Initiate the reverse transcription reaction by adding 1 μL of optimized dNTP mix. In optimization studies we have found that decreasing the dGTP concentration from 500 to 250 μM increases the sensitivity of C-to-T misincorporation. Incubate the reaction for one hour at 57 °C and proceed to PCR amplification step ( Section 2.3.3 ).

Note on additional controls: We recommend performing a reverse transcription reaction in the absence of template to ensure the reagents being used are free from contaminating RNA/DNA. It is also essential to include control reactions that lack RT enzyme for each biological replicate, which allows confirmation that the PCR reaction ( Section 2.3.3 ) is amplifying only cDNA generated through reverse transcription and not contaminating gDNA from other sources.


المواد والأساليب

جمع العينات

The study was approved by the Institutional Human Ethics Committee of All India Institute of Medical Sciences, Bhopal with the waiver of consent as per the “National Ethical Guidelines for Biomedical and Health Research” from Indian Council of Medical Research, a government body which makes and enforces policies of medical research in India. As per the guidelines, a waiver of consent may be granted by institutional ethics committee if the research is done on anonymized biological samples and/or the primary purpose of the research is refinement and improvement of the public health programs. As our study met both these criteria it the waiver of consent was granted. The study was conducted in 2 phases (a) pooled testing of simulated 5-sample pools, and (b) comparative evaluation of individualized and 4-sample pooled testing strategies. Nasopharyngeal and/or oropharyngeal swabs samples from COVID-19 suspects were collected by trained healthcare workers in Viral Transport Medium (VTM) and transported at 2–8°C to the Regional Virology Laboratory, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal. All samples used in this study were anonymized before being accessed by the research team. For the first phase of the study archived samples were used as described below, while the second phase was undertaken on freshly collected samples.

Simulated pooling of retrospective samples

In order to find out the relative performance of 5-sample pools comprising of varying proportions of positive and negative samples, we randomly chose 50 anonymized positive and 415 negative samples from our departmental repository collected between first week of April and second week of May 2020. These samples were accessed on May 20–27, 2020 for the experiments. We used a web-based random number generator to create simulated pools of different constitutions with positive and negative samples as depicted in Table 1 by mixing 200 μl of each sample in a microfuge tube.

Prospective consecutive pooling

For this part of the study, aliquots of 1000 consecutive samples were anonymized and processed parallelly for individualized and pooled testing in a blinded manner. To evaluate the sensitivity of pooled analysis in two different prevalence settings, 500 samples were collected in June 2020 (scenario 1) and another 500 in August 2020 (scenario 2) from the same geographical region. A total of 250 pools of 4 anonymized consecutive samples each (125 each in June and August 2020) were thus created by mixing 200 μl of each sample and tested for SARS-CoV-2 along with individual samples as described earlier [15].

RRT-PCR for COVID-19 diagnosis

RNA from the simulated pools and the samples of scenario 1 were extracted using MGI kit (BGI Biotechnology, Wuhan, China) as per the manufacturer’s protocol and subjected to COVID-19 diagnosis using Lab Gun® fluorescent rRT-PCR diagnostic kit (Lab Genomics, Suwon-si, Republic of Korea). RNA from samples collected in scenario 2 were extracted using Hi-Media Viral RNA extraction kit (Hi-Media) and rRT-PCR assays were performed using Meril Diagnostic (Vapi, India) and 3B BlackBio Biotech (Bhopal, India) as per the kit protocol.

Calculation of reduction in cost and turnaround time for COVID-19 rRT-PCR test

For calculating the expenditure of rRT-PCR test, cost of nucleic acid extraction kits RT-PCR kits and other laboratory consumables were taken in the account. In a single 96 well PCR plate 93 samples and three controls were run and total time to taken for one run was 6.5 h which included time for sample aliquoting, RNA extraction and performing the PCR.

إحصائيات

The quantification of agreement and bias between the individual Ct value and pool Ct value was determined by Bland-Altman (BA) plot. X-axis of BA plot represented mean Ct value of individual sample and pool while Y-axis represented difference in individual and pool Ct value. We estimated the agreement interval at 95% confidence interval (CI) and each x-y paired observation was colored as per the number of rRT-PCR positive sample(s) in the pool. The ‘BlandAltmanLeh’ and ‘ggplot2’ package with base R software was used to draw the plot.

In the next step the Kendell’s tau coefficient between individual Ct value and pooled Ct value was determined. The reason for choosing Kendell’s tau over other correlation measure (Pearson or Spearman measure) was influenced by the construct of the study where the estimated probability of agreeability (concordance) between the paired individual and pooled Ct value is a major concern. Kendell’s tau, being a distribution-free (independent) non-parametric quantile base measure, seems more robust in this scenario. We used ‘ggpubr’ in R for this purpose. In order to visualize the effect of number of RT-PCR positive samples in 4- and 5-sample pools on Ct value separately, we created the best fit line for nested subgroup as per number of positive samples in both 4-sample and 5-sample pools.


3. Methods

3.1. Isolation of Total RNA

Obtaining high quality and intact RNA is the first and often the most critical step in performing RT-PCR and real-time PCR. RNA is easily degraded since RNase is very hard to inactivate. Several precautions need to be taken to prevent RNA from degradation. People should always wear a clean lab coat, disposable gloves, and change gloves frequently. The bench should be clean. Any aqueous solutions, tubes, and pipettes used for the procedure should be sterile and RNAse-free. To avoid contaminating your sample with RNases, do not talk while processing RNA extraction.

Currently, there are a number of RNA isolation kits commercially available. Although it is convenient, time-saving, and avoids contact with phenol/chloroform using commercially available kits, those kits using silica-membrane spin columns may not be ideal for studies of insoluble nanoparticle since the nanoparticles may clog the membrane pore of the spin column. Therefore, it is important to choose the right reagents or kits for total RNA isolation according to different experiments and specific characteristics of different nanoparticles. In our laboratory, we use TRI Reagent to isolate total RNA for nanoparticle studies. TRI Reagent is a mixture of guanidine thiocyanate and phenol in a monophase solution, which can effectively dissolve DNA, RNA, and protein after homogenization or lysis of tissue samples. It performs well with large or small amounts of tissue or cells. Here, we describe the procedures for isolating total RNA using TRI Reagent according to the manufacturer's instructions (1).

3.1.1. Sample Preparation

Lyse or homogenize the sample (see Notes 1𠄳).

Tissue (see Note 4): homogenize tissue samples in TRI Reagent (1 ml per 50� mg of tissue) in an appropriate homogenizer (see Notes 5 and 6). The volume of the tissue should not exceed 10% of the volume of the TRI Reagent.

Monolayer cells: lyse cells directly on the culture dish or plate (see Notes 7 and 8). Use 1 ml of the TRI Reagent per 10 cm 2 of glass culture plate surface area. After addition of the reagent, the cell lysate should be passed several times through a pipette to form a homogenous lysate (see Note 9).

Suspension cells: isolate cells by centrifugation at 1,000 rpm for 5 min and then lyse in TRI Reagent by repeated pipetting. One milliliter of the reagent is sufficient to lyse 5� × 10 6 animal, plant, or yeast cells, or 10 7 bacterial cells (see Notes 10 and 11).

In order to minimize the possibility of DNA contamination in the RNA extracted by TRI Reagent, after homogenization, centrifuge the homogenate at 12,000 × ز for 10 min at 2𠄸ଌ to remove the insoluble material (extracellular membranes, polysaccharides, and high molecular mass DNA). The supernatant contains RNA and protein. If the sample had a high fat content, there will be a layer of fatty material on the surface of the aqueous phase that should be removed. Transfer the clear supernatant to a fresh tube.

To ensure complete dissociation of nucleoprotein complexes, allow samples to stand for 5 min at room temperature.

Add 0.2 ml of chloroform (see Note 12) per ml of TRI Reagent used. Cover the sample tightly, shake vigorously for 15 s, and allow to stand for 2� min at room temperature.

Centrifuge the resulting mixture at 12,000 × ز for 15 min at 2𠄸ଌ.

3.1.2. RNA Isolation

Transfer the colorless upper aqueous phase to a fresh tube and add 0.5 ml of isopropanol per ml of TRI Reagent used in Subheading 3.1.1, step 1 and mix. Allow the sample to stand for 5� min at room temperature (see Note 13).

Centrifuge at 12,000 × ز for 10 min at 2𠄸ଌ. The RNA precipitate will form a pellet on the side and bottom of the tube.

Remove the supernatant and wash the RNA pellet by adding a minimum of 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRI Reagent used in sample preparation (see step 1 of Subheading 3.1.1). Vortex the sample and then centrifuge at 7,500 × ز for 5 min at 2𠄸ଌ (see Notes 14 and 15).

Briefly dry the RNA pellet for 5� min by air-drying or under a vacuum (see Note 16). Add an appropriate volume of molecular grade water to the RNA pellet. To facilitate dissolution, mix by repeated pipetting with a micropipette at 55�ଌ for 10� min (see Note 17).

Measure the concentration of total RNA: in a sterile and RNase-free tube, add 48 μl of molecular grade and nuclease-free water and 2 μl of total RNA from step 3 to make a total volume of 50 μl. Mix well.

Measure the absorbance at 260 and 280 nm with a Spectrophotometer (DU 730 Spectrophotometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA) (see Notes 18�). 1أ260 unit/ml = 40 μg/ml.

3.2 Reverse Transcription

Reverse transcription involves the synthesis of DNA from RNA by using an RNA-dependent DNA polymerase, the يعكس of normal transcription, which is from RNA to DNA. Although there are many kits commercially available for RT, the reverse transcriptase used in those kits usually is M-MLV reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus or AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus. M-MLV reverse transcriptase is the preferred reverse transcriptase in cDNA synthesis for long messenger RNA (mRNA) templates (ϥ kb) because the RNase H activity of M-MLV reverse transcriptase is weaker than the commonly used AMV reverse transcriptase (2). Since M-MLV reverse transcriptase is less processive than AMV reverse transcriptase, therefore, more units of the M-MLV enzyme are required to generate the same amount of cDNA as in the AMV reaction (2). The following are the basic procedures for RT using M-MLV reverse transcriptase according to the manufacturer's instruction (2).

Preheat a water bath to 70ଌ.

In a sterile RNase-free 0.2 ml PCR tube, add 2 μl of Oligo (dT)18 primer (0.5 μg/μl) and 2 μg of total RNA in a total volume of 15 μl with molecular grade and nuclease-free water (total volume is 17 μl).

Put the PCR tubes which contain the primer and total RNA in a plastic PCR rack (see Note 22), then put the rack in the 70ଌ water bath for 5 min to melt secondary structures within the template.

Cool the samples immediately by putting the tubes on ice to prevent secondary structures from reforming.

In a new sterile RNase-free 0.5 ml tube, mix the following reagents according to the number of samples. Each reaction should contain: 1 μl M-MLV reverse transcriptase, 1.25 μl of 10 mM dNTP, 0.75 μl Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor, and 5 μl of 5× M-MLV reaction buffer (see Notes 23 and 24). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Spin the PCR tubes from step 4 briefly to collect the solution at the bottom of the tube and put the tubes back onto the PCR rack.

Add 8 μl of the above mixture (step 5) into each PCR tube, mix gently by flicking the tube, then spin briefly. The total volume in the PCR tube should now be 25 μl.

Put the PCR tubes on to a thermal cycler and incubate at 42ଌ for 60 min (see Note 25), at 94ଌ for 5 min, then keep at 4ଌ (see Note 26).

When finished, the samples can be stored at �ଌ for later PCR experiments.

3.3 تفاعل البلمرة المتسلسل

Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA polymerase, such as Taq polymerase. There are many DNA polymerases commercially available. Although their efficiency may be different, they are suitable for regular RT-PCR to determine the expression level of mRNA. Some experiments which will use PCR products for cloning purposes, especially those for cloning of promoter region with high G-C content, need to use high fidelity DNA polymerase. The PCR is commonly carried out in a reaction volume of 10� μl in small reaction tubes (0.2𠄰.5 ml volumes) in a thermal cycler. The following is an example of a PCR performed in our laboratory.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM each primer, 0.5 μl of 10 mM dNTP, 5 μl of 5× Green GoTaq Buffer, 0.25 μl GoTaq DNA polymerase (5 U/μl), and 16.25 μl of nuclease-free water (total 24 μl) (see Notes 27�). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each PCR tube, add 24 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each PCR tube. Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

Put the PCR tube onto a thermal cycler.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for PCR (see Notes 30�), then run.

Separate the PCR products by agarose gel electrophoresis and visualize with ethidium bromide (see Notes 35�).

After separation on an agarose gel, PCR products are visualized by Gel Doc XR ( Fig. 1 ) and analyzed by Quantity One.

mRNA expression level of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) by RT-PCR. Total RNA was extracted from human monocytes U937 by using TRI Reagent and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). PCR was performed on a thermal cycler (Mastercycler, Eppendorf) by using GoTaq DNA polymerase (Promega). The PCR products were separated on 1% agarose gel. Housekeeping gene GAPDH was used as internal control. M, 100 bp DNA Ladder (Fisher) (1) cells without any treatment were used as control (2) cells were treated with 5.0 μg/ml of cobalt nanoparticles for 24 h.

To semi-quantify the expression level of mRNA, intensities of target gene products are normalized to that of housekeeping gene to obtain the relative densities.

3.4. Real-Time PCR

Traditional PCR uses agarose gel for detection of PCR amplification at the final phase or endpoint of the PCR (plateau). However, real-time PCR allows for the detection of PCR amplification in the exponential growth phase of the reaction. Theoretically, there is a quantitative relationship between the amount of starting target sample and the amount of PCR product at any given cycle number. Real-time PCR detects the accumulation of amplicon during the reaction. The data is then measured at the exponential phase of the PCR, which makes quantitation of DNA and RNA easier and more precise than traditional methods. There are two methods, which are often used in the laboratory. One is the 5′ nuclease assay in which an oligonucleotide called a TaqMan® Probe is added to the PCR reagent master mix. This probe is designed to anneal to a specific sequence of template between the forward and reverse primers and is also designed with a high-energy dye termed a Reporter at the 5′ end, and a low-energy molecule termed a Quencher at the 3′ end. When this probe is intact and excited by a light source, the Reporter dye's emission is suppressed by the Quencher dye as a result of the close proximity of the dyes. When the probe is cleaved by the 5′ nuclease activity of the enzyme, the distance between the Reporter and the Quencher increases causing the transfer of energy to stop. The fluorescent emissions of the reporter increase and the quencher decrease. An increase in Reporter fluorescent signal is directly proportional to the number of amplicons generated. Another real-time PCR method is by using SYBR Green Dye, which can bind the minor groove of any double-stranded DNA molecule. When SYBR Green dye binds to double-stranded DNA, the intensity of the fluorescent emissions increases. As more double-stranded amplicons are produced, SYBR Green dye signal will increase. The following is an example of real-time PCR by using iQ™ SYBR Green Supermix and performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

Thaw all components used in step 2 at room temperature. Mix vigorously, and centrifuge to collect contents to the bottom of the tubes, then put the tubes on ice.

In a sterile nuclease-free microcentrifuge tube, mix the following reagents on ice. Each reaction contains: 1 μl of 5 μM of each primer, 10 μl of 2× iQ™ SYBR Green Supermix, and 7 μl of nuclease-free water (total 19 μl) (see Notes 38 and 39). Mix gently by flicking the tube, then spin briefly.

In each well of 96-well PCR plate, add 19 μl of the above mixture to the bottom of the tube.

Add 1 μl of cDNA sample in each well (see Note 40). Cover the plate with Microseal® 𠇋” Film (see Note 41).

Mix gently by flicking the tube, then spin the plate briefly.

Put the PCR plate in an iQ5 multicolor real-time PCR detection system.

According to the primers and the length of PCR product, set up parameters for real-time PCR, then run (see Notes 42�).

Analyze the data. If using SYBR Green, there should be only one peak in the melting curve ( Fig. 2 ) (see Note 45).

Real-time PCR for rabbit IL-1β. Rabbit ear skin wound tissues were used for total RNA isolation by TRI Reagent (Sigma) and reverse transcripted to cDNA by using M-MLV reverse transcriptase (Promega). Real-time PCR was performed on an iQ5 multicolor real-time PCR detection system (Bio-Rad) by using 2× iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). (أ) The amplification curves (ب) the melting curves. Single peak in the melting curve represents that only the real target gene is amplified (ج) the PCR standard curve (Color figure online).

In our laboratory, the relative expression level of each gene is calculated as fold dilution (see Note 46) by using a standard curve for each gene. Standard curves are obtained by real-time PCR using 3, 1, and 1 μl of 10-, 100-, and 1,000-fold dilution, respectively, of cDNA obtained from sample without any treatments (see Note 47). The expression level of each gene is then normalized to the relative expression level of housekeeping gene in the same sample.


Applications and Advantages RT-PCR

Applications: The reverse transcriptase PCR analysis is used in many bio-molecular analyses.

RT-PCR is the Golden Standard test for detecting viral infections, including HIV, HPV, SARS, COVID-19 coronavirus, etc.

Diagnosis and identification of microbial diseases

RT-PCR measures viral load and expression in infections

It determines tissue-specific gene expression and measures tissue-specific mutant alleles.

Applied in cancer therapy to monitor response and prognosis to therapy

Gene therapy and gene insertion studies apply RT-PCR techniques

A simple, rapid, cost-effective, and easy to use analysis

Quantitative and qualitative analysis can be done

Requires a smaller amount of sample

Complex electrophoresis after PCR processing is not necessary

Greater specificity and sensitivity


شاهد الفيديو: Six Sigma. 3 Ways to Interpret Variation. ثلاث طرق لتفسير الاختلاف في البيانات (أغسطس 2022).