معلومة

12.2H: الأجسام المضادة الفلورية - علم الأحياء

12.2H: الأجسام المضادة الفلورية - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

الأجسام المضادة الفلورية هي أجسام مضادة تم تمييزها بمركب فلورسنت لتسهيل اكتشافها في المختبر.

أهداف التعلم

  • صف كيف يمكن استخدام اتحادات الأضداد الفلورية في المقايسات المناعية للكشف عن البروتين

النقاط الرئيسية

  • يتم استخدام العلامات الفلورية للأجسام المضادة بدلاً من النظائر المشعة والإنزيمات لتعزيز حساسية ونوعية الاختبارات المناعية.
  • يمكن استخدام الأجسام المضادة الفلورية لتلطيخ البروتينات من مصل المريض أو أقسام الأنسجة المثبتة على شريحة أو الخلايا الحية المعلقة.
  • يمكن الكشف عن الأجسام المضادة الفلورية باستخدام المجهر الفلوري أو فارز خلايا التدفق.

الشروط الاساسية

  • النظائر المشعة: نظير مشع لعنصر ما.

وضع العلامات الفلورية طريقة أخرى لإثبات مدى تعقيد المستضدات والأجسام المضادة. تستخدم جزيئات الفلورسنت كبدائل للنظائر المشعة أو تسميات الإنزيم. تتكون تقنية الأجسام المضادة الفلورية من وضع علامات على الجسم المضاد بأصباغ مثل فلورسين أيزوثيوسيانات (FITC). هذه المركبات لها انجذاب كبير للبروتينات التي تقترن بها.

تعتبر تقنيات الفلورسنت محددة وحساسة للغاية ، لذا تتطلب التقنيات المعتمدة على الأجسام المضادة الفلورية مجهرًا فلوريًا. تمتص المادة الفلورية ضوءًا ذا طول موجي واحد وتنبعث منه ضوءًا بطول موجي أطول. يتألق الفلورسين بلون أخضر تفاحي كثيف عند الإثارة تحت الفحص المجهري الفلوري. لا يضعف التلاعب الكيميائي في وسم الأجسام المضادة بأصباغ فلورية للسماح بالكشف عن طريق الفحص المجهري المباشر نشاط الجسم المضاد.

بعد وسم جسم مضاد محدد بجزيء الفلورسنت ، لا يزال من الممكن تفاعله مع مستضده وتحديده مجهريًا. يشيع استخدام مقارنات الأجسام المضادة الفلورية في المقايسات المناعية. تشمل الطرق الأساسية التي تستخدم الأجسام المضادة الفلورية المقايسة المباشرة ، والتثبيط ، والمقايسة المناعية غير المباشرة.

في التقنية المباشرة ، يتم استخدام الجسم المضاد الفلوري للكشف عن تفاعلات الأجسام المضادة للمستضد على المستوى المجهري. مقايسة التألق المناعي للتثبيط هي اختبار منع حيث يتم تعريض المستضد لأول مرة لجسم مضاد غير مرمز ، ثم لجسم مضاد لفلوريسنت ، ثم يتم غسله وفحصه أخيرًا. يعتمد مقايسة التألق المناعي غير المباشر على قدرة الأجسام المضادة على التفاعل مع المستضدات وكذلك العمل كمستضدات والتفاعل مع الأجسام المضادة (مضاد الغلوبولين المناعي). تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للكشف عن الأجسام المضادة والأجسام المضادة للأنسجة والمستضدات الخلوية. يتم تنفيذ الطرق الموصوفة في الغالب على شرائح زجاجية مع مصل المريض أو أقسام الأنسجة. يمكن أيضًا إجراء التألق المناعي لتحديد مستضدات معينة على الخلايا الحية المعلقة. تُعرف هذه الطريقة باسم قياس التدفق الخلوي وتتطلب فارز خلايا التدفق بدلاً من مجهر الفلورسنت.


نصائح لتحسين بروتوكولات التألق المناعي للحصول على أفضل صورة

تشمل استخدامات التألق المناعي (IF) - حيث يتم اقتران الجسم المضاد بجزيء يتألق عند تحريضه بواسطة الليزر - توطين البروتين ، وتأكيد التعديل أو التنشيط اللاحق للترجمة ، والقرب من البروتينات الأخرى / معقدها. الكيمياء الخلوية المناعية (ICC) هي تقنية راسخة تستخدم الأجسام المضادة للارتباط بأهداف في عينات الخلايا ، و Coons وآخرون وصف لأول مرة الكشف المناعي باستخدام جزيء مراسل الفلورسنت في عام 1942. بالإضافة إلى توفير المعلومات حول الأهداف دون الخلوية ، ينتج عن الجمع بين التألق المناعي والكيمياء المناعية بعضًا من أكثر البيانات المرئية إلحاحًا في علوم الحياة. في هذا الدليل ، يشارك علماء الأجسام المضادة ما تعلمناه حول الحصول على أفضل صورة ممكنة من تجارب IF-ICC.

شكل 1. تحدد الكيمياء الخلوية المناعية (ICC) البروتينات المرتبطة بالنواة العصبية والسوما والمحاور (يسار). صحيح ، تلطيخ الفلورسنت المناعي لخط الخلايا البشرية U-251 MG.


عمليات نقل الإنزيمات أثناء تنشيط العضلات الملساء

رؤوف خليل ، كاثلين ج. مورجان ، في الكيمياء الحيوية لتقلص العضلات الملساء ، 1996

1 الفحص المجهري الإسفار في الخلايا الحية

يسمح الفحص المجهري الفلوري بدراسة التوزيع الخلوي للإنزيمات في الخلايا السليمة. يتوفر عدد قليل نسبيًا من المجسات للمراقبة المباشرة لتوزيع الكينازات في الخلايا الحية. أحد الأمثلة على ذلك هو مشتق phorbol استر الفلوريسنت Bodipy phorbol ، والذي تم استخدامه لتتبع توزيعات PKC في الخلايا الحية (خليل ومورجان ، 1991). هذا المركب نفاذ الغشاء ولكن له عيوب الاحتفاظ بنشاط ناهض PKC. أصبحت مجموعة المركبات التي تظهر عيبًا معاكسًا ، أي الاحتفاظ بالنشاط المضاد لـ PKC ، متاحة (Chen and Poenie ، 1993). تم وصف استخدام مؤشر قياس النسبة لمراقبة توزيع بروتين كينيز المعتمد على cAMP ونشاطه في الخلايا الحية (Bacskai وآخرون، 1993) ، ولكن في هذا الوقت لم يتم الإبلاغ عن استخدامه في العضلات الملساء. طريقة أخرى ذات صلة هي إدخال الأجسام المضادة الموصوفة في الخلايا السليمة فسيولوجيًا المنفعلة (Iizuka وآخرون، 1994). تكمن صعوبة هذا النهج في مشكلة ما إذا كان يمكن & quot حظر مواقع الربط غير المحددة & quot في الخلية السليمة.


أداة

أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية

تتكون أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية من ثلاثة أنظمة: السوائل ، والبصريات ، والإلكترونيات. يتكون نظام السوائل من سائل غمد (عادةً محلول ملحي مخزّن) يتم ضغطه لتسليم العينة وتركيزها على نقطة اعتراض الليزر أو نقطة الاستجواب حيث يتم تحليل العينة. يتكون النظام البصري من بصريات الإثارة (الليزر) وبصريات التجميع (الأنابيب المضاعفة الضوئية أو PMTs والصمامات الثنائية الضوئية) التي تولد إشارات الضوء المرئية والفلورية المستخدمة لتحليل العينة. تقوم سلسلة من المرشحات ثنائية اللون بتوجيه ضوء الفلوريسنت إلى أجهزة كشف محددة وتحدد مرشحات ممر النطاق الأطوال الموجية للضوء التي تتم قراءتها بحيث يمكن اكتشاف كل لون فلوروكروم فردي وقياسه. وبشكل أكثر تحديدًا ، فإن المرشحات ثنائية اللون عبارة عن مرشحات تمرر الضوء من خلالها إما أقصر أو أطول في الطول الموجي وتعكس الضوء المتبقي بزاوية. على سبيل المثال ، يسمح مرشح تمرير طويل مزدوج اللون 450 (DLP) للضوء الذي يبلغ طوله الموجي أطول من 450 نانومتر عبر الفلتر ويعكس أطوال موجات الضوء الأقصر بزاوية ليتم إرسالها إلى كاشف آخر. تكتشف مرشحات ممر النطاق نافذة صغيرة ذات طول موجي محدد للضوء. على سبيل المثال ، يمر مرشح ممر النطاق 450/50 ضوء الفلورسنت الذي يبلغ طوله الموجي 450 نانومتر + / & # x02212 25 نانومتر عبر المرشح ليقرأه الكاشف. يقوم النظام الإلكتروني بتحويل الإشارات من أجهزة الكشف إلى إشارات رقمية يمكن قراءتها بواسطة الكمبيوتر.

تعد أنظمة الليزر المتعددة شائعة مع الأدوات التي غالبًا ما تحتوي على 20 معلمة (FSC و SSC و 18 كاشفًا للفلوريسنت). هناك منصات أدوات جديدة يتم تقديمها بخمسة ليزر أو أكثر ومعلمات 30 & # x0201350 ، ولكنها أقل شيوعًا. أكثر أنواع الليزر المستخدمة في أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية هي 488 نانومتر (أزرق) ، 405 نانومتر (بنفسجي) ، 532 نانومتر (أخضر) ، 552 نانومتر (أخضر) ، 561 نانومتر (أخضر-أصفر) ، 640 نانومتر (أحمر) و 355 نانومتر (فوق بنفسجي) . أطوال موجات الليزر الإضافية متاحة للتطبيقات المتخصصة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أدوات حلت محل PMTs مع ثنائيات ضوئية الانهيار الجليدي (APD) للكشف عن التألق بهدف زيادة الحساسية.

أجهزة قياس تركيز الخلايا الصوتية

يستخدم جهاز قياس الخلايا هذا الموجات فوق الصوتية لتركيز الخلايا بشكل أفضل لاستجواب الليزر. يسمح هذا النوع من التركيز الصوتي بإدخال عينة أعلى وانسداد أقل للعينة. يمكن أن يستخدم مقياس الخلوي ما يصل إلى 4 أجهزة ليزر و 14 قناة مضان.

فارزات الخلايا

نوع معين من مقياس التدفق الخلوي التقليدي هو فارز الخلايا الذي يمكنه تنقية وجمع العينات لمزيد من التحليل. يسمح فارز الخلية للمستخدم بتحديد (بوابة) على مجموعة من الخلايا أو الجزيئات تكون موجبة (أو سلبية) للمعلمات المرغوبة ثم توجيه تلك الخلايا إلى وعاء تجميع. يقوم فارز الخلايا بفصل الخلايا عن طريق تذبذب تيار عينة السائل بتردد عالٍ لتوليد قطرات. يتم بعد ذلك إعطاء القطرات شحنة موجبة أو سالبة وتمريرها عبر ألواح انحراف معدنية حيث يتم توجيهها إلى وعاء تجميع معين بناءً على شحنتها. يمكن أن تكون أوعية التجميع عبارة عن أنابيب أو شرائح أو ألواح (96 بئر أو 384 بئراً شائعة).

هناك نوعان من أجهزة فرز الخلايا ، كوارتز كوفيت و # x0201cjet-in-air & # x0201d التي تختلف في مكان وجود نقطة الاستجواب بالليزر. تتميز أجهزة فرز خلايا الكوارتز بحواف محاذاة ليزر ثابتة وهي أسهل في التحضير للفرز. تحتاج أجهزة فرز الخلايا & # x0201cjet in air & # x0201d إلى محاذاة أشعة الليزر يوميًا ويكون إعدادها أكثر صعوبة ولكنها أكثر قابلية للتكيف لاكتشاف الجسيمات الصغيرة.

التصوير الخلوي

تجمع أجهزة قياس التدفق الخلوي بالتصوير (IFC) بين قياس التدفق الخلوي التقليدي والفحص المجهري الفلوري. يسمح هذا بالتحليل السريع لعينة من أجل التشكل والتألق متعدد المعلمات على كل من الخلية الواحدة ومستوى السكان (Barteneva، Fasler-Kan، & # x00026 Vorobjev، 2012). يمكن لـ IFC تتبع توزيعات البروتين داخل الخلايا الفردية مثل مجهر متحد البؤر أو مضان ولكن أيضًا لمعالجة أعداد كبيرة من الخلايا مثل مقياس التدفق الخلوي. إنها مفيدة بشكل خاص في تطبيقات متعددة مثل إشارات الخلية ، ودراسات التوطين المشترك ، والتفاعلات بين الخلية ، وتلف الحمض النووي وإصلاحه وأي تطبيق يحتاج إلى أن يكون قادرًا على تنسيق الموقع الخلوي مع التعبير الفلوري على مجموعات كبيرة من الخلايا.

أجهزة قياس الكتلة الخلوية

تجمع أجهزة قياس الكتلة الخلوية بين مطياف الكتلة وقت الرحلة وقياس التدفق الخلوي. يتم تمييز الخلايا بالأجسام المضادة ذات العلامات الأيونية الثقيلة (عادةً من سلسلة اللانثانيد) بدلاً من الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ويتم اكتشافها باستخدام مقياس الطيف الكتلي لوقت الرحلة. لا تحتوي أجهزة قياس الكتلة الخلوية على الكشف عن الضوء FSC أو SSC والذي لا يسمح بالطريقة التقليدية للكشف عن مجاميع الخلايا. ومع ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل تشفير الخلايا الشريطية لهذا الغرض (Leipold ، Newell ، & # x00026 Maecker ، 2015). أيضًا ، لا يحتوي قياس الكتلة الخلوية على إشارات تألق ذاتي خلوية ولا تحتوي الكواشف على التداخل الطيفي للانبعاثات المرتبط بملصقات الفلورسنت ، لذا لا يلزم التعويض. ومع ذلك ، يتم تدمير العينة أثناء التحليل ، وبالتالي فإن فرز الخلايا غير ممكن ومعدل الاستحواذ أقل بكثير من مقياس التدفق الخلوي القياسي (1000 خلية / ثانية بدلاً من 10000 خلية / ثانية). حاليًا ، هناك كواشف متاحة تجاريًا لـ 40 قناة ولكن هذا العدد سيزداد مع إدخال أيونات معدنية أخرى مثل البلاتين للاقتران بالأجسام المضادة (Mei، Leipold، & # x00026 Maecker، 2016).

أجهزة القياس الخلوي لتحليل صفيف الخرزة

أصبحت مصفوفات حبة Multiplex شائعة لتحليل كميات كبيرة من التحليلات في أحجام عينات صغيرة. باختصار ، تستخدم هذه المقايسات حبات الالتقاط بكمية معروفة من التألق في قناة محددة وجزيء مراسل تم اكتشافه بواسطة ليزر منفصل لتحديد كمية التحليلة الملتقطة المرتبطة بالخرز المحدد. وهو في الأساس يعادل 100 اختبار ELISA.

تم تطوير أجهزة قياس التدفق الخلوي الصغيرة التي تحتوي عادةً على ليزرين و 96 محملًا جيدًا لتحليل هذه المقايسات. تحتوي هذه الأدوات على آثار أقدام صغيرة وتصميمات مقاعد ضوئية تم تحسينها لاكتشاف وتمييز الخرز بكميات مختلفة من التألق على طول قناتين. تم تطوير أدوات يمكنها اكتشاف 100 & # x02013500 مجموعة مختلفة من الخرزات.

أجهزة التحليل الطيفية

أحد تحديات قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات هو التعويض (أو محو التداخل الطيفي) بين الفلوروكرومات. نوع جديد من مقياس التدفق الخلوي ، تم تصميم المحلل الطيفي خصيصًا لمعالجة هذه المشكلة. يقوم محلل الطيف بقياس أطياف انبعاث الفلورسنت بالكامل لكل فلوروكروم في عينة متعددة الألوان لإنشاء بصمة طيفية. ثم أثناء التحليل ، يتم فصل كل أطياف لتوفير إشارة نقية لكل لون فلوروكروم (سوني ، 2017). بدأ التحليل الطيفي ليحل محل اختبارات PMT التقليدية كطريقة للكشف عن قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد.

تقنيات الكشف الجديدة

تظل الأنابيب المضاعفة الضوئية (PMTs) هي تقنية الكاشف القياسية لقياس التدفق الخلوي. حساسيتها العالية وخلفياتها المنخفضة تجعلها مفيدة لتقنية التألق. ومع ذلك ، بدأت أجهزة الكشف عن الحالة الصلبة في الظهور في بعض أجهزة قياس السيتومتر. الثنائيات الضوئية الانهيار الجليدي (APDs) غير مكلفة وحساسة وخطية للغاية ، وأكثر استجابة للطيف في المنطقة الحمراء الطويلة. تعد الثنائيات الضوئية السيليكونية (SiPDs) أيضًا خيارًا واعدًا لكاشفات الحالة الصلبة.


ضوئي

في عام 2005 ، استحوذت شركة Active Motif على شركة Chromeon GmbH ، وهي شركة ألمانية أسسها البروفيسور أوتو ولفبيس ، الشركة الرائدة عالميًا في مجال المستشعرات الحيوية الفلورية. حددت شركة Chromeon GmbH في وقت مبكر الحاجة إلى تطوير فحوصات بيولوجية محسنة تعتمد على التألق.

من خلال إقران تطوير المقايسة لـ Active Motif مع الكيمياء الفلورية لـ Chromeon ، فإننا نسعى جاهدين لتطوير فحوصات الخلية والبيولوجيا الجزيئية المبتكرة التي تتضمن أصباغ الفلوريسنت والركائز التي تم تطويرها في شركة Chromeon GmbH. توفر أصباغ Active Motif Chromeo الحساسية والمرونة ، وتعرض خصائص التلألؤ الفائقة ، بما في ذلك مجموعة واسعة من الإثارة والانبعاثات الفلورية ، وتحولات Stokes الكبيرة ، وتبييض ضوئي محدود وتحمل واسع لدرجة الحموضة.

الفحص المجهري الفلوري مع الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية (Immunofluorescence ، أو IF) تستخدم على نطاق واسع للكشف عن بروتينات معينة في بيئتها الخلوية ، وللإجابة على الأسئلة المتعلقة بترتيبها وتعديلها وتفاعلاتها ودورة حياتها. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، كان استخدام الفحص المجهري الفلوري في أبحاث بيولوجيا الخلية محدودًا بالدقة التي يمكن تحقيقها في تجارب التصوير.

دقة الصور محدودة بحجم البقعة التي يمكن تركيز شعاع الإثارة من المجهر. هذا يعتمد على الطول الموجي للضوء المنبعث ومعلمات الجهاز. يحدد قانون آبي أعلى قرار يمكن تحقيقه:

الشكل 1: يصف قانون آبي الدقة التي يمكن تحقيقها في الفحص المجهري.

x = الدقة المكانية lambda = الطول الموجي للضوء المثار
2n sin & alpha = الفتحة العددية للميكروسكوب

ال حد آبي يقيد قدرة المراقب على حل الكائنات بشكل مرئي مفصولة بأقل من

200 نانومتر. هذا يجعل من المستحيل دراسة البكتيريا الصغيرة أو الفيروسات أو الريبوسومات أو مجموعات البروتين عن طريق الفحص المجهري الفلوري. ومع ذلك ، خلال السنوات القليلة الماضية ، تم تطوير العديد من التقنيات الجديدة التي تغلبت على هذا القيد.

الفحص المجهري عالي الدقة (المعروف أيضًا باسم الفحص المجهري عالي الدقة) مجموعة من التقنيات التي & ldquobreak & rdquo حاجز الانعراج ، مما يتيح دقة منخفضة تصل إلى 20-30 نانومتر. تستفيد هذه التقنيات من الفيزياء الخاصة وإعدادات أداة الأمبير ، وخصائص الأصباغ الفلورية عالية الجودة لتحسين الدقة بشكل كبير. على الرغم من أنه يمكن فصل هذه التقنيات إلى طريقتين مختلفتين ، إلا أن لها أساسًا مشتركًا واحدًا: القدرة على إيقاف تشغيل جزيئات الفلورسنت عند الرغبة.

الشكل 2: الأجسام المضادة الأولية لـ Active Motif والأجسام المضادة الثانوية الفلورية في الفحص المجهري متحد البؤر و STED.

كانت خلايا هيلا ملطخة بـ alpha Tubulin mouse mAb (Clone 5-B-1-2) و ATTO 647N (STED / GSD) Goat anti-mouse IgG (رقم الكتالوج 15038). تم تلوين هيستون H3 بجسم مضاد هيستون H3 ثلاثي ميثيل Lys4 الأرنب متعدد النسيلة (رقم الكتالوج 39159) والجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرنب كرومو 488 Goat (رقم الكتالوج 15041). الصور متحد البؤر (يسار) و STED (يمين) مقدمة من Leica Microsystems ، ألمانيا.

دقة فائقة عن طريق التصوير البصري المباشر

يعتمد النهج الأول على الفحص المجهري متحد البؤر ، حيث يتم إيقاف تشغيل الجزيئات الموجودة في المناطق الخارجية من البقعة البؤرية. هذا يقلل من حجم بقعة الفلورسنت ، حيث يُسمح فقط للأصباغ الموجودة في وسط منطقة الإثارة بإصدار التألق. STED (شارعمقلد هبعثة دepletion) و STED CW (جمحدود دبليوافي) تنتمي إلى تقنيات التصوير البصري المباشر هذه. لا تتطلب أي تقييم حسابي حيث يتم مسح العينات بالطريقة العادية. لمزيد من المعلومات ، يرجى زيارة صفحات منتجات الفحص المجهري STED.

دقة فائقة من خلال الترجمة

في هذا النهج ، يتم تحويل غالبية الجزيئات داخل المنطقة المثارة إلى حالة مظلمة ، يُسمح فقط لبعض جزيئات الصبغة المفردة بإصدار ضوء الفلورسنت. يتم تحديد موضع هذه الجزيئات الفردية بواسطة خوارزمية رياضية ، ويتم تصور كل منها. من خلال تكرار دورة إيقاف تشغيل الأصباغ واكتشاف وميض الباعث الفردي المتبقي ، يتم إنشاء آلاف الصور هذه الصور مجتمعة لتشكيل الصورة النهائية عالية الدقة. تنتمي العديد من التقنيات إلى هذه الفئة من القراءة العشوائية لتوطين الجزيء الفردي: عاصفه (شارععيني اptical صالبناء مالمجهرية) ، كف، نخلة (صهوتوأمقتطف إلocalization مالمجهرية) و GSDIM (جيمستدير ستايت دepletion مع أنافردي معودة olecule). لمزيد من المعلومات حول الفحص المجهري القائم على الترجمة ، يرجى زيارة صفحات منتجات الفحص المجهري GSDIM.

باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة ، من الممكن تجاوز حد Abbe وتحقيق تحسينات في الدقة تصل إلى 12 ضعفًا على الفحص المجهري متحد البؤر الكلاسيكي. تسهل القدرة على إجراء تجارب التصوير بدقة أقل من 50 نانومتر فصل الهياكل الخلوية الفرعية التي لم يكن بالإمكان حلها سابقًا ، وتزيد الثقة في الأدوار البيولوجية للبروتينات والهياكل التي تشترك في التوطين.


كشف

كشف عادة ما يتم تحقيقه باستخدام إحدى طريقتين: (أ) الكشف عن طريق قياس الألوان أو الإنزيم و (ب) الاكتشاف القائم على التألق.

في ال طريقة القياس اللوني، الجسم المضاد الأولي أو الثانوي المرتبط مع ركيزة ينتج عنها منتج ترسيب عند تحويله بواسطة إنزيم. هذا الراسب مرئي على شكل تلطيخ ملون عند رؤيته بالمجهر الضوئي.

في ال الكشف القائم على الأسفار الطريقة ، فإن الجسم المضاد المرتبط بمولد الضد المعني في الأنسجة مترافق بشكل مباشر أو غير مباشر مع حامل الفلور (يُسمى أحيانًا الفلوروكروم) ، وهو جزيء يتألق في وجود ضوء بطول موجي محدد.


12.2H: الأجسام المضادة الفلورية - علم الأحياء

أدى اكتشاف البروتين الفلوري الأخضر في أوائل الستينيات من القرن الماضي في نهاية المطاف إلى عصر جديد في بيولوجيا الخلية من خلال تمكين الباحثين من تطبيق طرق الاستنساخ الجزيئي ، ودمج جزء الفلوروفور في مجموعة متنوعة من أهداف البروتين والإنزيم ، من أجل مراقبة العمليات الخلوية في الأنظمة الحية باستخدام المجهر الضوئي والمنهجية ذات الصلة.عند اقترانه بالتطورات التقنية الحديثة في التألق واسع النطاق والفحص المجهري متحد البؤر ، بما في ذلك الكاميرات الرقمية فائقة السرعة ذات الإضاءة المنخفضة وأنظمة التحكم بالليزر متعددة المسارات ، أظهر البروتين الفلوري الأخضر ومشتقاته الوراثية المتغيرة الألوان خدمة لا تقدر بثمن في عدة آلاف من تجارب التصوير بالخلايا الحية .

شكل 1 - ملصقات البروتين الفلورية في الخلايا الحية

قام أوسامو شيمومورا وفرانك جونسون ، اللذان يعملان في مختبرات فرايداي هاربور بجامعة واشنطن في عام 1961 ، بعزل بروتين حيوي يعتمد على الكالسيوم من ايكوريا فيكتوريا قنديل البحر الذي أطلقوا عليه اسم اكورين. أثناء إجراء العزل ، لوحظ وجود بروتين ثان يفتقر إلى خصائص الإضاءة الحيوية الباعثة للأزرق من aequorin ، ولكنه كان قادرًا على إنتاج مضان أخضر عند إضاءته بالضوء فوق البنفسجي. بسبب هذه الخاصية ، تم تعميد البروتين في النهاية باسم غير رسمي بروتين الفلوريسنت الأخضر (GFP). على مدى العقدين التاليين ، قرر الباحثون أن الأيكورين والبروتين الفلوري الأخضر يعملان معًا في الأعضاء الخفيفة لقنديل البحر لتحويل إشارات الإنارة المستحثة بالكالسيوم إلى خاصية التألق الأخضر المميزة للأنواع.

على الرغم من استنساخ جين البروتين الفلوري الأخضر لأول مرة في عام 1992 ، إلا أن الإمكانات الكبيرة كمسبار جزيئي لم تتحقق إلا بعد عدة سنوات عندما تم استخدام منتجات الاندماج لتتبع التعبير الجيني في البكتيريا والديدان الخيطية. منذ هذه الدراسات المبكرة ، تم تصميم البروتين الفلوري الأخضر لإنتاج عدد كبير من المسوخات الملونة المختلفة ، وبروتينات الاندماج ، وأجهزة الاستشعار الحيوية التي يشار إليها على نطاق واسع بالبروتينات الفلورية. في الآونة الأخيرة ، تم التعرف على البروتينات الفلورية من الأنواع الأخرى وعزلها ، مما أدى إلى مزيد من التوسع في لوحة الألوان. مع التطور السريع لتكنولوجيا البروتين الفلوري ، أصبحت فائدة هذا الفلوروفور المشفر وراثيًا لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتجاوز التتبع البسيط للجزيئات الحيوية الموسومة في الخلايا الحية الآن موضع تقدير كامل.

يتضح في شكل 1 مثالان على العديد من علامات البروتين الفلوريسنت في الخلايا الحية باستخدام منتجات الاندماج التي تستهدف مواقع الخلايا الفرعية (العضية). الخلية الظهارية الأبوسوم القشرة الكلوية القريبة (نعم سطر) قدم في الشكل 1 (أ) تم نقل العدوى بمزيج من المتغيرات البروتينية الفلورية المندمجة في إشارات الببتيد التي تتوسط في النقل إلى أي من النواة (بروتين فلوري سماوي محسن) ECFP) ، الميتوكوندريا (بروتين الفلورسنت DsRed DSRed2FP) ، أو شبكة الأنابيب الدقيقة (بروتين الفلوري الأخضر المحسن EGFP). عينة مماثلة تتكون من الخلايا الظهارية لسرطان عنق الرحم البشري (هيلا سطر) في الشكل 1 (ب). تم نقل خلايا هيلا بشكل مشترك مع نواقل التوطين شبه الخلوية المدمجة في السماوي (مت تركواز) والأصفر (mVenus) تسلسلات ترميز البروتين الفلوري (معقد جولجي والنواة ، على التوالي) ، وكذلك بروتين "الفاكهة" ، mCherry ، الذي يستهدف شبكة الميتوكوندريا.

يتم استخدام البروتين الفلوري الأخضر ، وأشكاله الأليلية المتغيرة ، والبروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية والأصفر لبناء بروتينات خيمرية متألقة يمكن التعبير عنها في الخلايا الحية والأنسجة والكائنات الحية بأكملها ، بعد تعداء مع ناقلات هندسية. تم عزل البروتينات الفلورية الحمراء من الأنواع الأخرى ، بما في ذلك كائنات الشعاب المرجانية ، وهي مفيدة بالمثل. تتجنب تقنية البروتين الفلوريسنت مشكلة التنقية ، ووضع العلامات ، وإدخال البروتينات المصنفة في الخلايا أو مهمة إنتاج أجسام مضادة محددة لمولدات المضادات السطحية أو الداخلية.

خصائص وتعديلات البروتين الفلوري الأخضر Aequorea victoria Green

من بين أهم جوانب البروتين الفلوري الأخضر الذي يجب تقديره هو أن بنية الببتيد الأصلية البالغة 27 كيلو دالتون بأكملها ضرورية لتطوير مضانه والحفاظ عليه. من اللافت للنظر أن مبدأ الفلوروفور مشتق من ثلاثة توائم من الأحماض الأمينية المجاورة: بقايا السيرين والتيروزين والجليسين في المواقع 65 و 66 و 67 (يشار إليها باسم سير 65, صور 66، و Gly67 ارى الشكل 2). على الرغم من أن هذا النموذج البسيط من الأحماض الأمينية موجود بشكل شائع في جميع أنحاء الطبيعة ، إلا أنه لا يؤدي عمومًا إلى التألق. ما يميز البروتين الفلوري هو أن موقع هذا الببتيد الثلاثي يتواجد في وسط هيكل برميل مستقر بشكل ملحوظ يتكون من 11 بيتا- أوراق مطوية في أنبوب.

داخل البيئة الكارهة للماء في مركز البروتين الفلوري الأخضر ، يحدث تفاعل بين الكربون الكربوكسيل لـ Ser65 والنيتروجين الأميني لـ Gly67 الذي ينتج عنه تكوين نظام حلقة نيتروجين حلقي غير متجانس من imidazolin-5-one (كما هو موضح في الشكل 2). ينتج عن المزيد من الأكسدة اقتران حلقة إيميدازولين مع Tyr66 ونضج الأنواع الفلورية. من المهم أن نلاحظ أن الفلوروفور البروتين الفلوري الأخضر الأصلي موجود في حالتين. الشكل البروتوني ، الحالة السائدة ، له حد أقصى للإثارة عند 395 نانومتر ، وشكل أقل انتشارًا غير محفز يمتص عند حوالي 475 نانومتر. بغض النظر عن الطول الموجي للإثارة ، فإن انبعاث التألق له أقصى طول موجي عند 507 نانومتر ، على الرغم من أن الذروة واسعة وغير محددة جيدًا.

الشكل 2 - نضوج البروتين الفلوري الأخضر

هناك سمتان سائدتان لبروتين الفلورسنت الفلوري لهما آثار مهمة على فائدته كمسبار. أولاً ، الخصائص الفيزيائية الضوئية للبروتين الفلوري الأخضر باعتباره فلوروفور معقدة للغاية ، وبالتالي ، يمكن للجزيء أن يستوعب قدرًا كبيرًا من التعديل. ركزت العديد من الدراسات على الضبط الدقيق لإشعاع البروتين الفلوري الأخضر الأصلي لتوفير مجموعة واسعة من المجسات الجزيئية ، ولكن لا يمكن التقليل من الإمكانات الأكثر أهمية والواسعة لاستخدام البروتين كمواد أولية لبناء الفلوروفورات المتقدمة. الميزة الثانية المهمة للبروتين الفلوري الأخضر هي أن التألق يعتمد بشكل كبير على التركيب الجزيئي المحيط بالفلور ثلاثي الببتيد.

يؤدي تمسخ البروتين الفلوري الأخضر إلى تدمير الفلورة ، كما هو متوقع ، ويمكن للطفرات التي تحدث للمخلفات المحيطة بالفلوروفور ثلاثي الببتيد أن تغير خصائص التألق بشكل كبير. تعبئة بقايا الأحماض الأمينية داخل بيتا البرميل مستقر للغاية ، مما ينتج عنه عائد كمي مضان عالي جدًا (يصل إلى 80 بالمائة). يمنح هذا الهيكل البروتيني المحكم أيضًا مقاومة للاختلافات الفلورية بسبب التقلبات في درجة الحموضة ودرجة الحرارة ومحوّلات الطبيعة مثل اليوريا. يتم تغيير المستوى العالي من الاستقرار بشكل عام بطريقة سلبية من خلال الطفرات في البروتين الفلوري الأخضر الذي يزعج التألق ، مما يؤدي إلى تقليل العائد الكمي وزيادة الحساسية البيئية. على الرغم من أنه يمكن التغلب على العديد من هذه العيوب من خلال طفرات إضافية ، إلا أن البروتينات الفلورية المشتقة تكون عمومًا أكثر حساسية للبيئة من الأنواع المحلية. يجب مراعاة هذه القيود بجدية عند تصميم التجارب مع المتغيرات الجينية.

من أجل تكييف البروتينات الفلورية للاستخدام في أنظمة الثدييات ، تم إجراء العديد من التعديلات الأساسية للبروتين الفلوري الأخضر من النوع البري وتوجد الآن في جميع المتغيرات الشائعة الاستخدام. كانت الخطوة الأولى هي تحسين نضج الفلورة إلى بيئة 37 درجة مئوية. نضج الفلوروفور من النوع البري فعال للغاية عند 28 درجة ، ولكن زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة يقلل بشكل كبير من النضج الكلي ويؤدي إلى تقليل التألق. تحور بقايا فينيل ألانين في الموضع 64 (Phe64) إلى نتائج leucine في تحسين نضج التألق عند 37 درجة ، وهو ما يعادل على الأقل تلك الملاحظة عند 28 درجة. توجد هذه الطفرة في الأنواع الأكثر شيوعًا من البروتينات الفلورية المشتقة منها ايكوريا فيكتوريا، ولكنها ليست الطفرة الوحيدة التي تحسن الطي عند 37 درجة كما تم اكتشاف متغيرات أخرى.

بالإضافة إلى تحسين النضج عند 37 درجة ، أدى تحسين استخدام الكودون للتعبير عن الثدييات أيضًا إلى تحسين السطوع الكلي للبروتين الفلوري الأخضر المعبر عنه في خلايا الثدييات. إجمالاً ، تم إدخال أكثر من 190 طفرة صامتة في تسلسل الترميز لتعزيز التعبير في الأنسجة البشرية. موقع بدء ترجمة كوزاك (يحتوي على تسلسل النوكليوتيدات أ / GCCAT) عن طريق إدخال حمض أميني ثانٍ. أدت هذه ، إلى جانب مجموعة متنوعة من التحسينات الأخرى (التي تمت مناقشتها أدناه) ، إلى تحقيق مفيد للغاية لتصوير الخلايا الحية لخلايا الثدييات وهي شائعة في جميع المسابير الفلورية المستخدمة حاليًا والمشتقة من بروتين قنديل البحر الأصلي.

لوحة ألوان البروتين الفلورية

تم تطوير مجموعة واسعة من المتغيرات الجينية لبروتين الفلورسنت التي تتميز بملفات طيفية لانبعاث الفلورة تغطي تقريبًا طيف الضوء المرئي بأكمله (انظر الجدول 1). جهود الطفرات في الأصل ايكوريا فيكتوريا أدى البروتين الفلوري الأخضر لقنديل البحر إلى تحقيقات الفلورسنت الجديدة التي يتراوح لونها من الأزرق إلى الأصفر ، وهي من أكثر المسابير استخدامًا على نطاق واسع في الجسم الحي مراسل الجزيئات في البحوث البيولوجية. تم تطوير البروتينات الفلورية ذات الطول الموجي الأطول ، المنبعثة في المناطق الطيفية البرتقالية والحمراء ، من شقائق النعمان البحرية ، المرقص المخططوالشعاب المرجانية التي تنتمي إلى الطبقة أنثوزوا. لا يزال تم تعدين أنواع أخرى لإنتاج بروتينات مماثلة لها انبعاث مضان أزرق وأخضر وأصفر وبرتقالي وأحمر عميق. جهود البحث التنموي جارية لتحسين سطوع واستقرار البروتينات الفلورية ، وبالتالي تحسين فائدتها الإجمالية.

الجدول 1 - خصائص البروتين الفلوريسنت

بروتين
(اختصار)
الإثارة
أقصى
(نانومتر)
انبعاث
أقصى
(نانومتر)
مولار
انقراض
معامل في الرياضيات او درجة
الكم
أثمر
في الجسم الحي
بنية
نسبيا
سطوع
(٪ من EGFP)
GFP (بالوزن)395/47550921,0000.77أحادي المعدن*48
البروتينات الفلورية الخضراء
EGFP48450756,0000.60أحادي المعدن*100
زمرد48750957,5000.68أحادي المعدن*116
Superfolder GFP48551083,3000.65أحادي المعدن*160
أعظمي جرين49250555,0000.74أحادي المعدن121
mWasabi49350970,0000.80أحادي المعدن167
تاججفب48250558,2000.59أحادي المعدن*110
TurboGFP48250270,0000.53ثنائيات102
أكجفب48050550,0000.55أحادي المعدن*82
ZsGreen49350543,0000.91تيترامير117
T- الياقوت39951144,0000.60أحادي المعدن*79
البروتينات الفلورية الزرقاء
EBFP38344529,0000.31أحادي المعدن*27
EBFP238344832,0000.56أحادي المعدن*53
أزوريت38445026,2000.55أحادي المعدن*43
mTagBFP39945652,0000.63أحادي المعدن98
بروتينات فلورية سماوية
ECFP43947632,5000.40أحادي المعدن*39
مكفب43347532,5000.40أحادي المعدن39
سيرولين43347543,0000.62أحادي المعدن*79
مت تركواز43447430,0000.84أحادي المعدن*75
CyPet43547735,0000.51أحادي المعدن*53
AmCyan145848944,0000.24تيترامير31
ميدوري إيشي سماوي47249527,3000.90ثنائيات73
تاجكفب45848037,0000.57أحادي المعدن63
mTFP1 (أزرق مخضر)46249264,0000.85أحادي المعدن162
البروتينات الفلورية الصفراء
EYFP51452783,4000.61أحادي المعدن*151
توباز51452794,5000.60أحادي المعدن*169
كوكب الزهرة51552892,2000.57أحادي المعدن*156
سترين51652977,0000.76أحادي المعدن174
YPet517530104,0000.77أحادي المعدن*238
تاجيفب50852464,0000.60أحادي المعدن118
PhiYFP525537124,0000.39أحادي المعدن*144
ZsYellow152953920,2000.42تيترامير25
m الموزة5405536,0000.7أحادي المعدن13
بروتينات البرتقال الفلورية
كوسابيرا أورانج54855951,6000.60أحادي المعدن92
كوسابيرا أورانج 255156563,8000.62أحادي المعدن118
م البرتقال54856271,0000.69أحادي المعدن146
mOrange254956558,0000.60أحادي المعدن104
دتوماتو55458169,0000.69ثنائيات142
dTomato-Tandem554581138,0000.69أحادي المعدن283
TagRFP555584100,0000.48أحادي المعدن142
TagRFP-T55558481,0000.41أحادي المعدن99
DSRed55858375,0000.79تيترامير176
DSRed256358243,8000.55تيترامير72
DsRed-Express (T1)55558438,0000.51تيترامير58
DsRed- مونومر55658635,0000.10أحادي المعدن10
m اليوسفي56858538,0000.30أحادي المعدن34
بروتينات فلورية حمراء
روبي558605112,0000.35أحادي المعدن117
أبل56859275,0000.49أحادي المعدن109
م الفراولة57459690,0000.29أحادي المعدن78
AsRed257659256,2000.05تيترامير8
mRFP158460750,0000.25أحادي المعدن37
JRed58461044,0000.20ثنائيات26
مشيري58761072,0000.22أحادي المعدن47
هكريد 158861820,0000.015ثنائيات1
أم التوت59862586,0000.15أحادي المعدن38
dKeima-Tandem44062028,8000.24أحادي المعدن21
HcRed-Tandem590637160,0000.04أحادي المعدن19
mPlum59064941,0000.10أحادي المعدن12
AQ14359565590,0000.04تيترامير11
* ديمر ضعيف

المقدمة في الجدول 1 عبارة عن تجميع للخصائص المعروضة بواسطة العديد من متغيرات البروتين الفلوريسنت الأكثر شيوعًا وفائدة. إلى جانب الاسم الشائع و / أو الاختصار لكل بروتين فلورسنت ، وأطوال موجات ذروة الامتصاص والانبعاث (المعطاة بالنانومتر) ، ومعامل الانقراض المولي ، والعائد الكمي ، والسطوع النسبي ، و في الجسم الحييتم سرد الجمعيات الهيكلية. تم اشتقاق قيم السطوع المحسوبة من ناتج معامل الانقراض المولي والعائد الكمي ، مقسومًا على قيمة EGFP. تم إنشاء هذه القائمة من مصادر الأدبيات العلمية والتجارية ولا يُقصد منها أن تكون شاملة ، ولكنها تمثل بدلاً من ذلك مشتقات البروتين الفلورية التي حظيت باهتمام كبير في الأدبيات وقد تثبت قيمتها في الجهود البحثية. علاوة على ذلك ، تم تسجيل أطياف الامتصاص والانبعاثات الفلورية المدرجة في الجداول والموضحة أدناه في ظل ظروف خاضعة للرقابة وتم تطبيعها لأغراض المقارنة والعرض فقط. في التحقيقات المجهرية الفلورية الفعلية ، قد تختلف الملامح الطيفية والحد الأقصى لطول الموجة بسبب التأثيرات البيئية ، مثل الأس الهيدروجيني والتركيز الأيوني وقطبية المذيب ، وكذلك التقلبات في تركيز المسبار الموضعي. لذلك ، قد تختلف معاملات الانقراض المدرجة والعوائد الكمومية عن تلك التي لوحظت بالفعل في ظل الظروف التجريبية.

البروتينات الفلورية الخضراء

على الرغم من أن البروتين الفلوري الأخضر الأصلي ينتج تألقًا كبيرًا ومستقرًا للغاية ، فإن الحد الأقصى للإثارة يكون قريبًا من نطاق الأشعة فوق البنفسجية. نظرًا لأن الضوء فوق البنفسجي يتطلب اعتبارات بصرية خاصة ويمكن أن يتلف الخلايا الحية ، فهو غير مناسب بشكل عام لتصوير الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري البصري. لحسن الحظ ، يتم تحويل الحد الأقصى من الإثارة لبروتين الفلورسنت الأخضر بسهولة إلى 488 نانومتر (في المنطقة السماوية) عن طريق إدخال طفرة نقطة واحدة تغير السيرين في الموضع 65 إلى بقايا ثريونين (S65T). تظهر هذه الطفرة في أكثر أنواع البروتينات الفلورية الخضراء شيوعًا ، والتي يطلق عليها  المحسن GFP (EGFP) ، والذي يتوفر تجارياً في مجموعة واسعة من النواقل التي تقدمها شركة BD Biosciences Clontech ، إحدى الشركات الرائدة في تكنولوجيا البروتينات الفلورية. علاوة على ذلك ، يمكن تصوير النسخة المحسّنة باستخدام مجموعات المرشحات المتاحة بشكل شائع والمصممة للفلوريسين وهي من بين ألمع البروتينات الفلورية المتوفرة حاليًا. جعلت هذه الميزات بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن أحد أكثر المسابير شيوعًا وأفضل خيار لمعظم تجارب البروتين الفلوري أحادي التسمية. العوائق الوحيدة لاستخدام EGFP هي حساسية طفيفة للأس الهيدروجيني وميل ضعيف للتقليل.

بالإضافة إلى البروتين الفلوري الأخضر المحسن ، يتم حاليًا استخدام العديد من المتغيرات الأخرى في تصوير الخلايا الحية. قد يكون أحد أفضل هذه العناصر من حيث الثبات الضوئي والسطوع هو زمرد متغير ، ولكن عدم وجود مصدر تجاري حد من استخدامه. توفر العديد من المصادر متغيرات البروتين الفلوري الأخضر المتوافقة مع البشر والتي توفر مزايا مميزة لنقل طاقة الرنين الفلوري (أقلق) التجارب. استبدال بقايا فينيل ألانين في الموضع 64 لليوسين (F64L GFP2) ينتج طفرة تحافظ على ذروة الإثارة البالغة 400 نانومتر ويمكن أن تقترن كشريك فعال لبروتين الفلورسنت الأصفر المحسن. هناك نوع مختلف من S65C تم تقديم طفرة (عادةً ما تحل محل السيستين للسيرين) ذات ذروة الإثارة عند 474 نانومتر تجاريًا كشريك FRET أكثر ملاءمة لبروتين الفلورسنت الأزرق المعزز من النسخة الخضراء المحسنة ذات اللون الأحمر. أخيرًا ، يسمى بروتين الشعاب المرجانية ZsGreen1 وله ذروة انبعاث عند 505 نانومتر ، تم إدخاله كبديل لبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. عندما يتم التعبير عنها في خلايا الثدييات ، يكون ZsGreen1 ساطعًا جدًا بالنسبة إلى EGFP ، ولكن له فائدة محدودة في إنتاج طفرات الاندماج ، وعلى غرار بروتينات الشعاب المرجانية الأخرى ، يميل إلى تكوين رباعي الأبعاد.

البروتينات الفلورية الصفراء

بدأت عائلة البروتينات الفلورية الصفراء بعد أن أظهر التركيب البلوري للبروتين الفلوري الأخضر أن بقايا الثريونين 203 (Thr203) كان بالقرب من chromophore. تم إدخال تحور هذه البقايا إلى التيروزين لتحقيق الاستقرار في حالة الإثارة ثنائية القطب للحامل الصبغي وأدت إلى تحول 20 نانومتر إلى أطوال موجية أطول لكل من أطياف الإثارة والانبعاثات. أدت التحسينات الأخرى إلى تطوير  المحسن بروتين أصفر فلوري (EYFP) ، وهو أحد ألمع بروتينات الفلورسنت وأكثرها استخدامًا. يتحد طيف الانبعاث الفلوري والسطوع لبروتين الفلورسنت الأصفر المحسن لجعل هذا المسبار مرشحًا ممتازًا لتجارب التصوير متعدد الألوان في الفحص المجهري الفلوري. يعد البروتين الفلوري الأصفر المحسن مفيدًا أيضًا في تجارب نقل الطاقة عند إقرانه ببروتين الفلورسنت السماوي المحسن (ECFP) أو GFP2. ومع ذلك ، فإن البروتين الفلوري الأصفر يمثل بعض المشاكل من حيث أنه حساس للغاية لدرجة الحموضة الحمضية ويفقد ما يقرب من 50 في المائة من مضانه عند درجة الحموضة 6.5. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أيضًا أن EYFP حساس لأيونات الكلوريد والتبييض الضوئي بسهولة أكبر بكثير من البروتينات الفلورية الخضراء.

الشكل 3 - الملامح الطيفية للبروتينات الفلورية الشائعة

أدى التطوير المستمر لبنية البروتين الفلوري للانبعاثات الصفراء إلى حل العديد من المشكلات المتعلقة بالمجسات الصفراء. ال السترين متغير البروتين الفلوري الأصفر شديد السطوع بالنسبة إلى EYFP وقد ثبت أنه أكثر مقاومة للتبييض الضوئي ودرجة الحموضة الحمضية والتأثيرات البيئية الأخرى. مشتق آخر اسمه كوكب الزهرة، هو الأسرع نضجًا وأحد ألمع المتغيرات الصفراء التي تم تطويرها حتى الآن. بروتين الشعاب المرجانية ، ZsYellow1، المستنسخة في الأصل من أ زوانثوس الأنواع الأصلية في المحيطين الهندي والهادئ ، وتنتج انبعاث أصفر حقيقي وهي مثالية للتطبيقات متعددة الألوان. مثل ZsGreen1 ، هذا المشتق ليس مفيدًا في إنشاء عمليات اندماج مثل EYFP ويميل إلى تكوين رباعي الأبعاد. كان العديد من متغيرات البروتين الفلوري الأصفر الأكثر قوة مهمًا للنتائج الكمية في دراسات FRET ومن المحتمل أن تكون مفيدة في التحقيقات الأخرى أيضًا.

يتضح في الشكل 3 هي الملامح الطيفية للامتصاص والانبعاث للعديد من البروتينات الفلورية شائعة الاستخدام والمتاحة تجاريًا ، والتي تمتد على الطيف المرئي من السماوي إلى الأحمر البعيد. المتغيرات مشتقة من ايكوريا فيكتوريا قنديل البحر ، بما في ذلك البروتينات الفلورية السماوية والأخضر والأصفر المحسنة ، تظهر أطوال موجات انبعاث قصوى تتراوح من 425 إلى 525 نانومتر. تنبعث البروتينات الفلورية المشتقة من الشعاب المرجانية ، DsRed2 و HcRed1 (التي تمت مناقشتها أدناه) ، أطوال موجية أطول ولكنها تعاني من آثار قليلة القلة في خلايا الثدييات.

البروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية

نتجت المتغيرات الزرقاء والسماوية للبروتين الفلوري الأخضر عن التعديل المباشر لبقايا التيروزين في الموضع 66 (صور 66) في الفلوروفور الأصلي (انظر الشكل 2). ينتج عن تحويل هذا الحمض الأميني إلى الهيستيدين انبعاث أزرق له طول موجي أقصى يبلغ 450 نانومتر ، بينما ينتج عن التحويل إلى التربتامين ذروة مضان كبيرة حوالي 480 نانومتر إلى جانب كتف يبلغ ذروته حوالي 500 نانومتر.كلا المجسين يتألقان بشكل ضعيف ويتطلبان طفرات ثانوية لزيادة كفاءة الطي والسطوع الكلي. حتى مع التعديلات ، فإن الإصدارات المحسّنة في هذه الفئة من البروتينات الفلورية (EBFP و ECFP) حوالي 25 إلى 40 في المائة فقط من السطوع مثل البروتين الفلوري الأخضر المحسن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إثارة البروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية هي الأكثر فعالية في المناطق الطيفية التي لا يتم استخدامها بشكل شائع ، لذلك يلزم وجود مجموعات مرشحات متخصصة ومصادر ليزر.

على الرغم من عيوب البروتينات الفلورية الزرقاء والسماوية ، فإن الاهتمام الواسع النطاق بوضع العلامات متعدد الألوان و FRET قد شاع تطبيقهما في عدد من التحقيقات. هذا ينطبق بشكل خاص على البروتين الفلوري السماوي المحسن ، والذي يمكن تحفيزه خارج الذروة بواسطة ليزر الأرجون أيون (باستخدام خط طيفي 457 نانومتر) وهو أكثر مقاومة للتبييض الضوئي من المشتق الأزرق. على عكس البروتينات الفلورية الأخرى ، لم يكن هناك مستوى عالٍ من الاهتمام بتصميم تحقيقات أفضل في المنطقة الزرقاء من طيف الضوء المرئي ، وقد ركزت غالبية الأبحاث التنموية على الفلوروفور في هذه الفئة على المتغيرات السماوية.

الشكل 4 - الملامح الطيفية لمتغيرات البروتين الفلوريسنت FRET Pail

من بين البروتينات الفلورية السماوية المحسنة التي تم إدخالها ، AmCyan1 ومتغير سماوي محسن يسمى سيرولين إظهار الوعد الأكبر. مستمدة من الشعاب المرجانية ، أنيمونيا ماجانو، تم تحسين متغير البروتين الفلوري AmCyan1 مع الكودونات البشرية لتوليد مستوى سطوع نسبي مرتفع ومقاومة لتبييض الصور عند مقارنتها ببروتين الفلورسنت السماوي المحسن أثناء تعبير الثدييات. على الجانب السلبي ، على غرار معظم بروتينات الشعاب المرجانية الأخرى ، يميل هذا المسبار إلى تكوين مركبات رباعية. تم تطوير مسبار Cerulean الفلوري من خلال الطفرات الموجهة بالموقع لبروتين الفلورسنت السماوي المعزز لإعطاء معامل انقراض أعلى وعائد كمي محسن. يعتبر Cerulean أكثر إشراقًا مرتين على الأقل من بروتين الفلورسنت السماوي المحسن ، وقد ثبت أنه يزيد بشكل كبير من نسبة الإشارة إلى الضوضاء عندما يقترن ببروتينات الفلورسنت الصفراء ، مثل فينوس (انظر الشكل 4) ، في تحقيقات FRET.

بروتينات فلورية حمراء

أصبح الهدف الرئيسي لتطوير البروتين الفلوري هو بناء مشتق ينبعث منه اللون الأحمر والذي يعادل أو يتجاوز الخصائص المتقدمة لبروتين الفلوريسنت الأخضر المحسن. من بين مزايا البروتين الفلوري الأحمر المناسب التوافق المحتمل مع المجاهر متحد البؤر وعريض المجال (ومجموعات المرشحات الخاصة بهم) ، إلى جانب زيادة القدرة على تصوير حيوانات بأكملها ، والتي تكون أكثر شفافية للضوء الأحمر. لأن بناء المسوخ الأحمر من ايكوريا فيكتوريا أثبت البروتين الفلوري الأخضر لقنديل البحر خارج المنطقة الطيفية الصفراء أنه غير ناجح إلى حد كبير ، وقد حول الباحثون بحثهم إلى الشعاب المرجانية الاستوائية.

تم اشتقاق أول بروتين فلوري مشتق من المرجان يتم استخدامه على نطاق واسع من المرقص المخطط ويشار إليه عادة باسم DSRed. بمجرد أن ينضج تمامًا ، يتميز طيف الانبعاث الفلوري لـ DsRed بقمة تبلغ 583 نانومترًا بينما يبلغ طيف الإثارة ذروة كبيرة عند 558 نانومتر وذروة ثانوية تبلغ حوالي 500 نانومتر. ومع ذلك ، ترتبط العديد من المشكلات باستخدام DsRed. نضوج مضان DsRed يحدث ببطء ويستمر خلال فترة زمنية عندما يكون انبعاث التألق في المنطقة الخضراء. يطلق عليه دولة خضراء، أثبتت هذه القطعة الأثرية أنها تمثل مشكلة بالنسبة لتجارب وضع العلامات المتعددة مع البروتينات الفلورية الخضراء الأخرى بسبب التداخل الطيفي. علاوة على ذلك ، DsRed هو رباعي ملزم ويمكن أن يشكل تجمعات بروتينية كبيرة في الخلايا الحية. على الرغم من أن هذه الميزات غير مهمة لاستخدام DsRed كمراسل للتعبير الجيني ، فإن فائدة DsRed كعلامة حلقية محدودة للغاية. على عكس البروتينات الفلورية لقنديل البحر ، والتي تم استخدامها بنجاح لتمييز مئات البروتينات ، أثبتت اقترانات DsRed أنها أقل نجاحًا وغالبًا ما تكون سامة.

تم التغلب على عدد قليل من مشاكل البروتينات الفلورية DsRed من خلال الطفرات. الجيل الثاني من DsRed ، المعروف باسم DSRed2، يحتوي على العديد من الطفرات في نهاية الببتيد الأمينية التي تمنع تكوين مجاميع البروتين وتقلل من السمية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقليل وقت نضج الفلوروفور مع هذه التعديلات. لا يزال بروتين DsRed2 يشكل رباعي الأبعاد ، لكنه أكثر توافقًا مع البروتينات الفلورية الخضراء في تجارب وضع العلامات المتعددة بسبب النضج الأسرع. تم تحقيق المزيد من التخفيضات في وقت النضج مع الجيل الثالث من طفرات DsRed ، والتي تعرض أيضًا مستوى سطوعًا متزايدًا من حيث ذروة التألق الخلوي. انبعاث مضان أحمر من DsRed- اكسبريس يمكن ملاحظتها في غضون ساعة بعد التعبير ، مقارنة بحوالي ست ساعات لـ DsRed2 و 11 ساعة لـ DsRed. متغير خميرة محسّن ، يُطلق عليه نجمة حمراءتم تطويره بحيث يحتوي أيضًا على معدل نضج محسّن وزيادة سطوع. إن وجود الحالة الخضراء في DsRed-Express و RedStar ليس واضحًا ، مما يجعل هذه البروتينات الفلورية هي الخيار الأفضل في المنطقة الطيفية البرتقالية الحمراء لتجارب وضع العلامات المتعددة. نظرًا لأن هذه المجسات تظل ملزمة رباعي الأبعاد ، فهي ليست الخيار الأفضل لوصف البروتينات.

الشكل 5 - الملامح الطيفية للبروتينات الفلورية البرتقالية والحمراء

تم عزل العديد من البروتينات الفلورية الحمراء الإضافية التي تظهر قدرًا كبيرًا من الوعود عن الكائنات المرجانية في الشعاب المرجانية. واحدة من أولى التطبيقات التي يتم تكييفها لتطبيقات الثدييات هي هكريد 1التي كانت معزولة عن مغاير كريسبا وهو متوفر الآن تجاريًا. تم اشتقاق HcRed1 في الأصل من بروتين كروموبروتين غير فلوري يمتص الضوء الأحمر من خلال الطفرات لإنتاج ثنائيات إجبارية ضعيفة الفلورسنت لها أقصى امتصاص عند 588 نانومتر وبحد أقصى للانبعاث يبلغ 618 نانومتر. على الرغم من أن طيف الانبعاث الفلوري لهذا البروتين مناسب للفصل عن DsRed ، إلا أنه يميل إلى التجميع المشترك مع DsRed ويكون أقل سطوعًا. تم إنتاج بنية HcRed مثيرة للاهتمام تحتوي على جزيئين مترادفين للتغلب على التباين الذي يحدث ، من حيث المبدأ ، بشكل تفضيلي داخل الاقتران الترادفي لإنتاج علامة أحادية. ومع ذلك ، نظرًا لأن السطوع الكلي لهذا البروتين المزدوج لم يتحسن بعد ، فهو ليس خيارًا جيدًا للتطبيقات الروتينية في الفحص المجهري للخلية الحية.

تطوير متغيرات البروتين الفلورية الأحادية

في حالتها الطبيعية ، توجد معظم البروتينات الفلورية على شكل ثنائيات ، أو رباعيات ، أو أوليغومرات عالية المستوى. بطريقة مماثلة، ايكوريا فيكتوريا يُعتقد أن البروتين الفلوري الأخضر يشارك في مركب رباعي مع aequorin ، ولكن لوحظت هذه الظاهرة فقط عند تركيزات عالية جدًا من البروتين ، كما أن ميل البروتينات الفلورية لقنديل البحر إلى التضاؤل ​​يكون ضعيفًا جدًا بشكل عام (وجود ثابت تفكك أكبر من 100 ميكرومولار). وبالتالي لم يتم ملاحظة تناقص البروتينات الفلورية بشكل عام عندما يتم التعبير عنها في أنظمة الثدييات. ومع ذلك ، عندما يتم استهداف البروتينات الفلورية لمقصورات خلوية معينة ، مثل غشاء البلازما ، يمكن أن يصبح تركيز البروتين الموضعي من الناحية النظرية مرتفعًا بما يكفي للسماح بالثنائيات. هذا مصدر قلق خاص عند إجراء تجارب FRET ، والتي يمكن أن تسفر عن مجموعات بيانات معقدة يمكن اختراقها بسهولة عن طريق القطع الأثرية ثنائية الأبعاد.

لقد ثبت أن إنشاء متغيرات DsRed أحادية اللون مهمة صعبة. كانت هناك حاجة إلى أكثر من 30 تعديلاً على الأحماض الأمينية في الهيكل لإنشاء الجيل الأول من بروتين DsRed أحادي (يسمى طلب تقديم العروض 1). ومع ذلك ، فإن هذا المشتق يقلل بشكل كبير من انبعاث التألق مقارنة بالبروتين الأصلي وتبيض الصور بسرعة كبيرة ، مما يجعله أقل فائدة بكثير من البروتينات الفلورية الخضراء والصفراء الأحادية. تتواصل جهود أبحاث الطفرات ، بما في ذلك التقنيات الجديدة مثل فرط الحركة الجسدية ، في البحث عن متغيرات البروتين الفلوري الأصفر والبرتقالي والأحمر والعميق الأحمر التي تقلل بشكل أكبر من ميل هذه المجسات البيولوجية التي يحتمل أن تكون فعالة إلى الارتباط الذاتي مع دفع الحد الأقصى للانبعاثات في نفس الوقت. نحو أطوال موجية أطول.

يجري تطوير بروتينات فلورية أحادية مُحسَّنة أدت إلى زيادة معاملات الانقراض ، والعوائد الكمومية ، والثبات الضوئي ، على الرغم من عدم وجود متغير واحد قد تم تحسينه بكل المعايير. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التغلب على مشاكل التعبير مع البروتينات الفلورية الحمراء الرباعية الملزمة من خلال الجهود المبذولة لتوليد متغيرات أحادية ، والتي أسفرت عن مشتقات أكثر توافقًا مع الوظيفة البيولوجية.

ربما كان التطور الأكثر إثارة على هذه الجبهة هو إدخال حصاد جديد من البروتينات الفلورية المشتقة من بروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي من خلال الطفرات الموجهة التي تستهدف س 66 و Y67 بقايا. سميت بالفواكه التي تعكس ألوانًا مشابهة لملف طيف انبعاث التألق (انظر الجدول 1 و الشكل 5) ، يعرض هذا الكادر من البروتينات الفلورية الأحادية الحد الأقصى بأطوال موجية تتراوح من 560 إلى 610 نانومتر. أدى التوسع الإضافي لهذه الفئة من خلال فرط الحركة الجسدي التكراري إلى إنتاج بروتينات فلورية بأطوال موجية انبعاثية تصل إلى 650 نانومتر. تملأ هذه البروتينات الجديدة بشكل أساسي الفجوة بين البروتينات الفلورية لقنديل البحر ذات الانزياح الأحمر الأكثر (مثل فينوس) ، والبروتينات الفلورية الحمراء للشعاب المرجانية. على الرغم من أن العديد من هذه البروتينات الفلورية الجديدة تفتقر إلى السطوع والاستقرار اللازمين للعديد من تجارب التصوير ، إلا أن وجودها مشجع لأنه يشير إلى احتمالية وجود بروتينات فلورية أحادية اللون ساطعة ومستقرة عبر الطيف المرئي بأكمله.

محددات بصرية

كان أحد أكثر التطورات إثارة للاهتمام في أبحاث البروتين الفلوري هو تطبيق هذه المجسات على شكل جزيئي أو محددات بصرية (ارى الجدول 2) ، والتي تغير اللون أو شدة الانبعاث نتيجة لتحفيز الفوتون الخارجي أو مرور الوقت. على سبيل المثال ، تؤدي طفرة نقطة واحدة إلى ببتيد قنديل البحر الأصلي إلى إنشاء نسخة قابلة للنشاط الضوئي من البروتين الفلوري الأخضر (المعروف باسم PA-GFP) التي تتيح التحويل الضوئي لقمة الإثارة من الأشعة فوق البنفسجية إلى اللون الأزرق عن طريق الإضاءة بالضوء في نطاق 400 نانومتر. يحتوي PA-GFP غير المحول على ذروة إثارة مماثلة في المظهر الجانبي لتلك الخاصة بالبروتين من النوع البري (حوالي 395 إلى 400 نانومتر). بعد التحويل الضوئي ، تزيد ذروة الإثارة عند 488 نانومترًا بمقدار 100 ضعف تقريبًا. يثير هذا الحدث اختلافات تباين عالية جدًا بين المجمعات غير المحولة والمحولة لـ PA-GFP وهو مفيد لتتبع ديناميكيات المجموعات السكانية الفرعية الجزيئية داخل الخلية. يتضح في الشكل 6 (أ) هي خلية ثديية حية منقولة تحتوي على PA-GFP في السيتوبلازم التي يتم تصويرها بإثارة ليزر أرجون أيون 488 نانومتر من قبل (الشكل 6 (أ)) و بعد (الشكل 6 (د)) التحويل الضوئي باستخدام ليزر ديود أزرق بحجم 405 نانومتر.

الجدول 2 - خصائص محددات التظليل الضوئية المختارة

بروتين
(اختصار)
الإثارة
أقصى
(نانومتر)
انبعاث
أقصى
(نانومتر)
مولار
انقراض
معامل في الرياضيات او درجة
الكم
أثمر
في الجسم الحي
بنية
نسبيا
سطوع
(٪ من EGFP)
PA-GFP (G)50451717,4000.79أحادي المعدن41
PS-CFP (C)40246834,0000.16أحادي المعدن16
PS-CFP (G)49051127,0000.19أحادي المعدن15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08أحادي المعدن3
كورال هيو كايدي (G)50851898,8000.88تيترامير259
كورال هو كايدي (على اليمين)57258060,4000.33تيترامير59
wtKikGR (G)50751753,7000.70تيترامير112
wtKikGR (R)58359335,1000.65تيترامير68
mKikGR (G)50551549,0000.69أحادي المعدن101
mKikGR (R)58059128,0000.63أحادي المعدن53
dEosFP- ترادفي (G)50651684,0000.66أحادي المعدن165
dEosFP- ترادفي (R)56958133,0000.60أحادي المعدن59
mEos2FP (G)50651956,0000.84أحادي المعدن140
mEos2FP (R)57358446,0000.66أحادي المعدن90
Dendra2 (G)49050745,0000.50أحادي المعدن67
Dendra2 (R)55357335,0000.55أحادي المعدن57
كورال هوو درونبا (G)50351895,0000.85أحادي المعدن240
Kindling (KFP1)58060059,0000.07تيترامير12

يمكن أيضًا استخدام البروتينات الفلورية الأخرى كمظلات ضوئية. إن الإثارة ثلاثية الفوتونات (عند أقل من 760 نانومتر) من البروتين الفلوري DsRed قادرة على تحويل التألق الأحمر الطبيعي إلى اللون الأخضر. من المحتمل أن يكون هذا التأثير بسبب التبييض الضوئي الانتقائي للكروموفور الأحمر في DsRed ، مما أدى إلى تألق يمكن ملاحظته من الحالة الخضراء. ال الموقت يتحول متغير DsRed تدريجياً من اللون الأخضر اللامع (انبعاث 500 نانومتر) إلى اللون الأحمر الفاتح (انبعاث 580 نانومتر) على مدار عدة ساعات. يمكن بعد ذلك استخدام النسبة النسبية من التألق الأخضر إلى الأحمر لجمع البيانات الزمنية لتحقيقات التعبير الجيني.

أداة تمييز بصرية قابلة للتحويل ، تسمى PS-CFP، المشتق من الطفرات لمتغير البروتين الفلوري الأخضر ، وقد لوحظ أنه ينتقل من السماوي إلى التألق الأخضر عند الإضاءة عند 405 نانومتر (لاحظ التحويل الضوئي للخلية المركزية في الشكلان 6 (ب) و 6 (هـ)). معبراً عنه كمونومر ، من المحتمل أن يكون هذا المسبار مفيدًا في تحقيقات التبييض الضوئي والتحويل الضوئي والتنشيط الضوئي. ومع ذلك ، فإن الإسفار من PS-CFP أضعف بمقدار 2.5 ضعفًا تقريبًا من PA-GFP وهو أدنى من أدوات التمييز الأخرى من حيث كفاءة التحويل الضوئي (التحول 40 نانومتر في انبعاث التألق عند التحويل الضوئي أقل مما لوحظ مع تحقيقات مماثلة). الطفرات الإضافية لهذا البروتينات الفلورية أو ذات الصلة لديها القدرة على إنتاج المزيد من المتغيرات المفيدة في منطقة الطول الموجي هذه.

الشكل 6 - البروتينات الفلورية للضوء الضوئي

تم تطوير أدوات التظليل الضوئية أيضًا في بروتينات الفلورسنت المستنسخة من أنواع المرجان وشقائق النعمان. كايدي، وهو بروتين فلوري معزول عن المرجان الصخري ، يتحول من اللون الأخضر إلى الأحمر في وجود الضوء فوق البنفسجي. على عكس PA-GFP ، يحدث تحويل الفلورة في Kaede عن طريق امتصاص الضوء الذي يختلف طيفيًا عن الإضاءة. لسوء الحظ ، هذا البروتين هو رباعي ملزمة ، مما يجعله أقل ملاءمة لاستخدام الفراء كعلامة حلقية من PA-GFP. مرجان آخر رباعي الحجر (لوبوفيليا hemprichii) متغير البروتين الفلوري ، يسمى EosFP (ارى الجدول 2) ، ينبعث منها فلور أخضر ساطع يتحول إلى أحمر برتقالي عند إضاءته بالأشعة فوق البنفسجية عند 390 نانومتر تقريبًا. في هذه الحالة ، يتم إنتاج التحول الطيفي عن طريق تعديل ناتج عن الصورة يتضمن انقطاعًا في العمود الفقري للببتيد المجاور للكروموفور. أدت الطفرات الإضافية لبروتين EosFP "النوع البري" إلى مشتقات أحادية ، والتي قد تكون مفيدة في بناء بروتينات الاندماج.

ثالث غير-ايكوريا هايلايتر بصري تألق بروتين الفلوريسنت (KFP1) من بروتين كروموبروتين غير فلوري معزول في Anemonia sulcata، وهو متوفر الآن تجاريًا (Evrogen). لا يُظهر بروتين التألق الفلوري انبعاثًا حتى يضيء بالضوء الأخضر. ينتج عن الضوء منخفض الشدة وميض أحمر عابر يتحلل خلال بضع دقائق (انظر الميتوكوندريا في الشكل 6 (ج)). تعمل الإضاءة بالضوء الأزرق على إخماد الفلورة المشتعلة على الفور ، مما يسمح بالتحكم الصارم في وضع العلامات الفلورية. في المقابل ، ينتج عن الإضاءة عالية الكثافة إشعال لا رجعة فيه ويسمح بإبراز ثابت مشابه لـ PA-GFP (الشكل 6 (و)). تعد القدرة على التحكم الدقيق في التألق مفيدة بشكل خاص عند تتبع حركة الجسيمات في بيئة مزدحمة. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا النهج بنجاح لتتبع مصير خلايا الصفائح العصبية في التطور Xenopus الأجنة وحركة الميتوكوندريا الفردية في خلايا PC12.

مع استمرار تطوير أدوات التظليل الضوئية ، يجب أن تتطور البروتينات الفلورية المفيدة لوضع العلامات الضوئية نحو المتغيرات الأحادية السطوع التي يمكن تحويلها ضوئيًا بسهولة وعرض مجموعة واسعة من ألوان الانبعاث. إلى جانب هذه التطورات ، ستصبح المجاهر المجهزة للتنسيق السلس بين أوضاع الإضاءة لمراقبة التألق ووضع العلامات الإقليمية شائعة في مختبرات بيولوجيا الخلية. في نهاية المطاف ، هذه الابتكارات لديها القدرة على تحقيق إنجازات كبيرة في الديناميات المكانية والزمانية لأنظمة تحويل الإشارة.

نواقل البروتين الفلوريسنت ونقل الجينات

تعد البروتينات الفلورية متعددة الاستخدامات وقد تم استخدامها بنجاح في كل تخصص بيولوجي تقريبًا من علم الأحياء الدقيقة إلى فسيولوجيا الأنظمة. كانت هذه المسابير في كل مكان مفيدة للغاية كمراسلين لدراسات التعبير الجيني في الخلايا والأنسجة المستزرعة ، وكذلك الحيوانات الحية. في الخلايا الحية ، يتم استخدام البروتينات الفلورية بشكل شائع لتتبع توطين وديناميكيات البروتينات والعضيات والمقصورات الخلوية الأخرى. تم تطوير مجموعة متنوعة من التقنيات لبناء منتجات انصهار البروتين الفلوري وتعزيز تعبيرها في الثدييات والأنظمة الأخرى. إن المركبات الأساسية لإدخال تسلسل الجينات الوراثية للبروتين الفلوري في الخلايا هي البلازميدات الجرثومية والناقلات الفيروسية المعدلة وراثيًا.

يمكن إدخال منتجات الانصهار الجيني للبروتين الفلوري في خلايا الثدييات وغيرها باستخدام الناقل المناسب (عادةً البلازميد أو الفيروس) إما بشكل عابر أو مستقر. في تجارب نقل الجينات العابرة أو المؤقتة (يشار إليها غالبًا باسم تعداء عابر) أو البلازميد أو الحمض النووي الفيروسي الذي يتم إدخاله في الكائن الحي المضيف لا يندمج بالضرورة في الكروموسومات ، ولكن يمكن التعبير عنه في السيتوبلازم لفترة قصيرة من الزمن. التعبير عن منتجات الاندماج الجيني ، التي تتم مراقبتها بسهولة من خلال مراقبة انبعاث الفلورة باستخدام مجموعة مرشح متوافقة مع البروتين الفلوري ، يحدث عادةً على مدى عدة ساعات بعد تعداء العدوى ويستمر لمدة 72 إلى 96 ساعة بعد إدخال DNA البلازميد في خلايا الثدييات . في كثير من الحالات ، يمكن دمج DNA البلازميد في الجينوم في حالة دائمة لتشكيل خطوط خلوية متغيرة بشكل ثابت. يعتمد اختيار تعداء العدوى العابرة أو المستقرة على الأهداف المستهدفة للتحقيق.

الشكل 7 - ناقل توطين الشبكة الإندوبلازمية EYFP

يحتوي التكوين الأساسي لمتجه البلازميد المفيد في تجارب نقل جينات البروتين الفلوري على العديد من المكونات المطلوبة. يجب أن يحتوي البلازميد على تسلسلات نيوكليوتيدات بدائية النواة مشفرة لأصل النسخ المتماثل البكتيري للحمض النووي والجين المقاوم للمضادات الحيوية. غالبًا ما يطلق على هذه العناصر خدمة النقل متواليات ، تسمح بانتشار واختيار البلازميد داخل مضيف بكتيري لتوليد كميات كافية من المتجه لانتقال العدوى في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يحتوي البلازميد على واحد أو أكثر من العناصر الجينية حقيقية النواة التي تتحكم في بدء نسخ الحمض النووي الريبي المرسال ، وإشارة تعدد الأدينيل للثدييات ، وإنترون (اختياري) ، وجين للاختيار المشترك في خلايا الثدييات. تعد عناصر النسخ ضرورية لمضيف الثدييات للتعبير عن منتج اندماج الجينات محل الاهتمام ، وعادة ما يكون جين الانتقاء مضادًا حيويًا يمنح مقاومة للخلايا التي تحتوي على البلازميد. تختلف هذه الميزات العامة وفقًا لتصميم البلازميد ، والعديد من النواقل لها طيف واسع من المكونات الإضافية المناسبة لتطبيقات معينة.

يتضح في الشكل 7 هو إنزيم التقييد والخريطة الجينية لمشتق بلازميد بكتيري متاح تجاريًا (BD Biosciences Clontech) يحتوي على تسلسل ترميز لبروتين فلوري أصفر مُحسّن مدمج في الشبكة الإندوبلازمية لتسلسل استهداف الكالريتيكولين (بروتين مقيم). ينتج عن التعبير عن هذا المنتج الجيني في خلايا الثدييات الحساسة ببتيد خيمري يحتوي على EYFP المترجمة إلى شبكة الغشاء الشبكي الإندوبلازمي ، المصمم خصيصًا لوضع العلامات الفلورية لهذه العضية. متجه المضيف هو مشتق من pUC رقم نسخة عالية (حوالي 500) بلازميد يحتوي على أصل التكاثر البكتيري ، مما يجعله مناسبًا للتكاثر المتخصص بكتريا قولونية سلالات. يتم التعبير عن جين المضاد الحيوي كانامايسين بسهولة في البكتيريا ويمنح مقاومة ليكون بمثابة علامة انتقائية.

الميزات الإضافية لمتجه EYFP المعروضة أعلاه هي الفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV) محفز لقيادة التعبير الجيني في خطوط الخلايا البشرية والثدييات الأخرى المنقولة ، و و 1 أصل تكاثر الجراثيم لإنتاج الحمض النووي أحادي الجديلة. يحتوي العمود الفقري المتجه أيضًا على فيروس قرد 40 (SV40) أصل النسخ المتماثل ، والذي ينشط في خلايا الثدييات التي تعبر عن مستضد SV40 T. اختيار المطهرات المستقرة مع المضاد الحيوي G418 يتم تمكينه بشريط مقاومة النيومايسين يتكون من مروج مبكر SV40 ، وجين مقاومة النيومايسين (aminoglycoside 3’-phosphotransferase) ، وإشارات تعدد الأدينيل من فيروس الهربس البسيط thymidine kinase (HSV-TK) لاستقرار الرسول. ستة مواقع فريدة لإنزيم التقييد (انظر الشكل 7) على العمود الفقري للبلازميد ، مما يزيد من تعدد استخدامات هذا البلازميد.

التكاثر ، والعزل ، وترنسفكأيشن من البروتين الفلوريسنت البلازميدات

تعتمد تجارب تعداء الثدييات الناجحة على استخدام نواقل دنا عالية الجودة أو بلازميد فيروسية خالية نسبيًا من السموم الداخلية البكتيرية. في الحالة الأصلية ، تظهر جزيئات DNA البلازميد الدائرية الدرجة الثالثة ملفوف التشكل الذي يلف الحلزون المزدوج حول نفسه عدة مرات. لسنوات عديدة ، كانت الطريقة المفضلة لتنقية الحمض النووي للفيروس والبلازميد الفائق الالتفاف هي الطرد المركزي المتدرج لكثافة كلوريد السيزيوم في وجود عامل إقحام (مثل بروميد الإيثيديوم أو يوديد البروبيديوم). تقوم هذه التقنية ، المكلفة من حيث المعدات والمواد ، بفصل الحمض النووي (DNA) فائق الالتفاف من الكروموسومات الخطية والحمض النووي الدائري المكسور وفقًا لكثافة الطفو ، مما يتيح جمع DNA البلازميد عالي النقاء. في الآونة الأخيرة ، طرق كروماتوغرافيا عمود التبادل الأيوني المبسطة (يطلق عليها عادة أ مصغرة الإعدادية) إلى حد كبير محل بروتوكول الطرد المركزي المرهق والمستهلك للوقت لإنتاج كميات كبيرة من DNA البلازميد الخالي من السموم الداخلية في فترة زمنية قصيرة نسبيًا.

تسمى الطفرات البكتيرية المتخصصة مختص الخلايا ، من أجل تضخيم ملائم ورخيص نسبيًا لناقلات البلازميد. تحتوي البكتيريا على مجموعة من الطفرات التي تجعلها عرضة بشكل خاص لتكاثر البلازميد ، وقد تم نفاذها كيميائيًا لنقل الحمض النووي عبر الغشاء وجدار الخلية في إجراء يُعرف باسم تحويل. بعد التحول ، يتم إنماء البكتيريا إلى الطور اللوغاريتمي في وجود اختيار المضاد الحيوي الذي يمليه البلازميد. تتركز الثقافة البكتيرية عن طريق الطرد المركزي ويتم تعطيلها عن طريق التحلل بمحلول منظف قلوي يحتوي على إنزيمات لتحطيم الحمض النووي الريبي الملوث. ثم يتم ترشيح المحلول ووضعه على عمود التبادل الأيوني. يتم غسل المواد غير المرغوب فيها ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات ، تمامًا من العمود قبل التصفية من الحمض النووي البلازميدي باستخدام محلول ملح عالي. يركز ترسيب الكحول (الأيزوبروبانول) على الحمض النووي البلازميدي ، الذي يتم جمعه بالطرد المركزي ، وغسله ، وإعادة إذابته في المخزن المؤقت. DNA البلازميد المنقى جاهز للعمل في تجارب تعداء.

الشكل 8 - تعداء الخلايا الدهنية في خلايا الثدييات

يجب أن تكون خلايا الثدييات المستخدمة في ترنسفكأيشن في حالة فسيولوجية ممتازة وأن تنمو في الطور اللوغاريتمي أثناء الإجراء. تم تطوير مجموعة واسعة من كواشف تعداء الخلايا تجاريًا لتحسين امتصاص البلازميد DNA بواسطة الخلايا المستنبتة. تتراوح هذه التقنيات من ترسيب فوسفات الكالسيوم البسيط إلى عزل DNA البلازميد في الحويصلات الدهنية التي تلتحم بغشاء الخلية وتوصيل المحتويات إلى السيتوبلازم (كما هو موضح في الشكل 8). جماعيا التهاب الشحوم، لاقت التكنولوجيا القائمة على الدهون قبولًا واسعًا نظرًا لفعاليتها في عدد كبير من خطوط الخلايا الشائعة ، وهي الآن الطريقة المفضلة لمعظم تجارب تعداء العدوى.

على الرغم من أن العدوى العابرة العابرة عادة ما تؤدي إلى فقدان منتج الجين البلازميد خلال فترة زمنية قصيرة نسبيًا (عدة أيام) ، تستمر خطوط الخلايا المنقولة بشكل ثابت في إنتاج البروتينات الضيفة على أساس طويل الأمد (يتراوح من أشهر إلى سنوات). يمكن اختيار خطوط الخلايا المستقرة باستخدام علامات المضادات الحيوية الموجودة في العمود الفقري البلازميد (انظر الشكل 7). أحد أكثر المضادات الحيوية شيوعًا لاختيار مضادات العدوى المستقرة في خطوط خلايا الثدييات هو عقار G418 المانع لتخليق البروتين ، لكن الجرعة المطلوبة تختلف اختلافًا كبيرًا وفقًا لكل خط خلوي. المضادات الحيوية الشائعة الأخرى ، بما في ذلك هيدرومايسين ب و بوروميسين، تم تطويره أيضًا من أجل الانتقاء المستقر للخلايا ، وكذلك العلامات الجينية. الطريقة الأكثر فاعلية للحصول على خطوط خلوية مستقرة هي استخدام تقنية عالية الكفاءة لترنسفكأيشن الأولي. في هذا الصدد، التفريد الكهربي أثبتت قدرتها على توليد مواد انتقالية مستقرة مع بلازميدات خطية وجينات نقية. يطبق Electroporation نبضات قصيرة وعالية الجهد على تعليق خلوي للحث على تكوين المسام في غشاء البلازما ، مما يسمح لاحقًا للحمض النووي للعدوى بدخول الخلية. تعد المعدات المتخصصة ضرورية للتثقيب الكهربائي ، ومع ذلك ، فإن هذه التقنية قابلة للمقارنة من حيث التكلفة مع كواشف إزالة الدهون عند إجراء عدد كبير من عمليات التحويل.

مستقبل البروتينات الفلورية

يتركز تركيز تطوير البروتين الفلوري الحالي على هدفين أساسيين. الأول هو إتقان وضبط اللوحة الحالية من البروتينات الفلورية الصفراء إلى الزرقاء المشتقة منها ايكوريا فيكتوريا قنديل البحر ، بينما الهدف الثاني هو تطوير بروتينات فلورية أحادية تنبعث من اللون البرتقالي إلى مناطق حمراء بعيدة من طيف الضوء المرئي. كان التقدم نحو هذه الأهداف مثيرًا للإعجاب ، وليس من المستبعد أن تلوح في الأفق البروتينات الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء.

نجح أحدث جيل من أنواع قنديل البحر في حل معظم أوجه القصور في الجيل الأول من البروتينات الفلورية ، خاصةً بالنسبة للمشتقات الصفراء والخضراء. أدى البحث عن بروتين فلورسنت أحمر أحادي اللون ومشرق وسريع النضج إلى ظهور عدة فئات جديدة ومثيرة للاهتمام من البروتينات الفلورية ، لا سيما تلك المشتقة من الأنواع المرجانية. سيؤدي تطوير البروتينات الفلورية الموجودة ، جنبًا إلى جنب مع التقنيات الجديدة ، مثل إدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، إلى زيادة توسيع لوحة الألوان. نظرًا لتطور تقنيات الفصل الطيفي البصري بشكل أفضل وانتشارها ، فإن هذه الأنواع الجديدة ستكمل اللوحة الحالية ، خاصة في المناطق الصفراء والحمراء من الطيف.

الاتجاه الحالي في تكنولوجيا المسبار الفلوري هو توسيع دور الأصباغ التي تتألق في الأشعة الحمراء البعيدة والأشعة تحت الحمراء القريبة. في خلايا الثدييات ، يتم تقليل كل من التألق الذاتي وامتصاص الضوء بشكل كبير في الطرف الأحمر من الطيف. وبالتالي ، فإن تطوير مجسات الفلورسنت الحمراء البعيدة سيكون مفيدًا للغاية لفحص العينات السميكة والحيوانات بأكملها. بالنظر إلى نجاح البروتينات الفلورية كمراسلين في الأنظمة المعدلة وراثيًا ، فإن استخدام البروتينات الفلورية الحمراء البعيدة في الكائنات الحية الكاملة سيصبح مهمًا بشكل متزايد في السنوات القادمة.

أخيرًا ، يتم الآن تحقيق الإمكانات الهائلة في تطبيقات البروتين الفلوريسنت لهندسة المستشعرات الحيوية. عدد بنيات جهاز الاستشعار الحيوي يتزايد بسرعة. باستخدام المعلومات الهيكلية ، أدى تطوير هذه المجسات إلى تحسين الحساسية وسيستمر في القيام بذلك. يشير نجاح هذه المساعي بالتأكيد إلى أن أي معلمة بيولوجية تقريبًا ستكون قابلة للقياس باستخدام جهاز الاستشعار الحيوي المناسب القائم على البروتين الفلوري.

المؤلفون المساهمون

ديفيد دبليو بيستون - قسم الفسيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية ، جامعة فاندربيلت ، ناشفيل ، تينيسي ، 37232.

جورج اتش باترسون و جينيفر ليبينكوت شوارتز - فرع بيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي ، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، ماريلاند ، 20892.

ناثان س و مايكل دبليو ديفيدسون - مختبر المجال المغناطيسي الوطني العالي ، 1800 East Paul Dirac Dr. ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي ، فلوريدا ، 32310.

منتجات نيكون ذات الصلة

مكعبات الفلورسنت الفلورية

تقدم نيكون مجموعة كبيرة من مكعبات مرشح التألق بكفاءة عالية في اكتساب الفلورة لدعم تصوير مجموعة كبيرة ومتنوعة من الفلوريات والبروتينات الفلورية.

مصادر الاضاءة

توفر نيكون مصادر ضوء لمجموعة واسعة من احتياجات التصوير ، بدءًا من الأنظمة المحورية للتنظير المجسم إلى أجهزة الإضاءة القائمة على LED لتطبيقات epi-fluorescence ووحدات الليزر القوية لتطبيقات التصوير المتقدمة. تتضمن العديد من حلول الإضاءة لدينا تطبيقات فريدة ويمكن تشغيلها للتحكم عالي السرعة.


أوراق البحث الأصلية

Coons ، A. H. ، Creech ، H. J. & amp Jones ، R.N. الخصائص المناعية لجسم مضاد يحتوي على مجموعة فلورية. بروك. شركة على سبيل المثال. بيول. ميد. 47, 200–202 (1941)

Coons ، A. H. ، Creech ، H. J. ، Jones ، R.N & amp Berliner ، E. عرض مستضد المكورات الرئوية في الأنسجة باستخدام الأجسام المضادة الفلورية. J. إمونول. 45, 159–170 (1942)

قراءة متعمقة

Coons، A.H & amp Kaplan، M. H. توطين المستضد في خلايا الأنسجة: تحسينات في طريقة للكشف عن المستضد عن طريق الأجسام المضادة الفلورية. ياء إكسب. ميد. 91, 1–13 (1950)

Coons ، A. H. بدايات التألق المناعي. J. إمونول. 87, 499–503 (1961)


تصميم قائم على المعرفة للمستشعرات الحيوية الفلورية غير الكاشفة من الأجسام المضادة المؤتلفة

إن إمكانية الحصول من أي جسم مضاد على اتحاد فلورسنت يستجيب لارتباط مولد الضد من خلال تباين في تألقه ، سيكون ذا أهمية كبيرة في العلوم التحليلية وبناء رقائق البروتين. تم استكشاف هذا الاحتمال باستخدام الجسم المضاد mAbD1.3 الموجه ضد الليزوزيم بياض بيض الدجاج. تم تطوير قواعد التصميم لتحديد بقايا الجسم المضاد التي يمكن أن يقترن بها الفلوروفور كيميائيًا ، بعد تغييرها إلى السيستين عن طريق الطفرات. استندت هذه القواعد إلى: البقايا المستهدفة التي تنتمي إلى جوار طوبولوجي لمولد الضد في هيكل المركب بين الجسم المضاد ومولد الضد ، وغياب الأهمية الوظيفية للتفاعل مع مولد الضد وإمكانية الوصول إلى المذيب في بنية الجسم المضاد الحر. تم إنشاء سبعة عشر اتحادًا بين الجزء المتغير أحادي السلسلة scFv لـ mAbD1.3 وفلوروفور حساس للبيئة. بالنسبة لستة من البقايا العشرة التي تفي تمامًا بقواعد التصميم ، فإن التباين النسبي لشدة التألق بين الحالات الحرة والمحدودة للاقتران يتألف من 12 إلى 75 ٪ (في المخزن المؤقت غير الأمثل) ، وتقارب الاتحاد بالنسبة إلى الليزوزيم بقي دون تغيير بالنسبة إلى scFv الأبوي. في المقابل ، كانت هذه النتائج صحيحة بالنسبة لواحد فقط من البقايا السبعة التي فشلت في تلبية إحدى القواعد وتم استخدامها كعناصر تحكم. تمت دراسة أحد الاتحادات بمزيد من التفصيل. زاد تألقه بشكل متناسب مع تركيز الليزوزيم في نطاق نانومولار ، حتى 90٪ في محلول محدد ، و 40٪ في مصل الدم. كانت هذه الزيادة خاصة ببيضة الدجاج الليزوزيم ولم يتم ملاحظتها مع بروتين وثيق الصلة وهو ليسوزيم بيض الديك الرومي. المخلفات التي أعطت اقترانات تشغيلية (ستة في V.إل وواحد في V.ح) ، في المنطقة المجاورة مباشرة للمخلفات المهمة وظيفيًا ، على طول تسلسل FvD1.3. تشير النتائج إلى قواعد تصميم لبناء اتحادات فلورية حساسة للمستضد من أي جسم مضاد ، في غياب البيانات الهيكلية.



تعليقات:

  1. Thurlow

    هذه هي الفضيحة!

  2. Imran

    أنا نهائي ، أنا آسف ، لكن هذا لا يقترب مني تمامًا.

  3. Zunos

    لا كلمات ، فقط المشاعر

  4. Moogur

    الرسالة ذات الصلة :) ، جذب ...

  5. Benon

    أود أن أكتب لك زوجين لطيفين هنا ، لكنني سأمتنع. التعليم لا يسمح))))



اكتب رسالة