معلومة

ما هي أدوار جوانيدين حمض الهيدروكلوريك والإيثانول في ربط الحمض النووي للسيليكا؟

ما هي أدوار جوانيدين حمض الهيدروكلوريك والإيثانول في ربط الحمض النووي للسيليكا؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول أن أفهم بالضبط كيف تعمل خطوة الربط مع هلام السيليكا (في مجموعات) ولا يمكنني العثور على أي أوراق تقدم شرحًا للفيزياء أو الكيمياء ؛ خاصة على الطريقة التي يعمل بها Guanidine-HCl.

لذلك دعنا نحصل عليهم من البداية.

بادئ ذي بدء ، نقوم بتعديل شروط ربط الحمض النووي عن طريق إضافة مخزن مؤقت يتضمن Guanidine-HCl والإيثانول ثم نقوم بالطرد المركزي للعينة لدينا. كنت أعلم أن Guanidine-HCl يدمر البنية الثلاثية للبروتينات ولكن في مكان ما قرأت أنه يساعد أيضًا الحمض النووي على الارتباط بعمود السيليكا. لقد بحثت لأجد الطريقة التي تعمل بها ولكني لم أتمكن من العثور على ورقة. وأيضًا ما هو دور الإيثانول في هذه الخطوة؟ هل هو فقط لإزالة البروتينات والسكريات من العينة؟


Guanidine HCL هو ملح شوتروبيك. تعتبر أملاح Chaotropic ضرورية لتحلل الخلايا وربطها براتنج السيليكا. على وجه التحديد ، Chaotropes لها دورين مهمين في استخراج الحمض النووي

  1. زعزعة استقرار روابط الهيدروجين وقوى فان دير فال والتفاعلات الكارهة للماء.

    • يؤدي إلى زعزعة استقرار البروتينات (بما في ذلك نوكليازات nucleases).

      تعتمد البنية والوظيفة الجزيئية على التأثير الصافي لهذه القوى (انظر طي البروتين) ، وبالتالي فإن زيادة المواد المذابة في النظام البيولوجي ستفسد الجزيئات الكبيرة ، وتقلل من النشاط الأنزيمي وتحفز الضغط على الخلية (أي الخلية. سوف تضطر إلى تجميع المواد الواقية من الإجهاد). يعتمد طي البروتين العالي على قوى كارهة للماء من الأحماض الأمينية خلال تسلسل البروتين. تقلل المواد المذابة Chaotropic من التأثير الكارهة للماء للمناطق الكارهة للماء بسبب اضطراب جزيئات الماء المجاورة للبروتين. هذا يذوب المنطقة الكارهة للماء في المحلول ، وبالتالي تغيير طبيعة البروتين. وينطبق هذا أيضًا بشكل مباشر على المنطقة الكارهة للماء في طبقات ثنائية الدهون ؛ إذا تم الوصول إلى تركيز حرج لمذاب شوتروبيك (في المنطقة الكارهة للماء من الطبقة الثنائية) ، فسوف تتأثر سلامة الغشاء ، وسوف تتلاشى الخلية. [مصدر]

  2. يعطل ارتباط الأحماض النووية بالماء.

    • وبالتالي توفير الظروف المثلى لانتقالها إلى السيليكا.

      يمكن أن يكون للأملاح خصائص تشوتروبيك عن طريق حماية الشحنات ومنع استقرار جسور الملح. تكون الرابطة الهيدروجينية أقوى في الوسائط غير القطبية ، لذا فإن الأملاح ، التي تزيد من القطبية الكيميائية للمذيب ، يمكن أن تزعزع أيضًا استقرار الرابطة الهيدروجينية. من الناحية الميكانيكية ، هذا بسبب عدم وجود جزيئات ماء كافية لإذابة الأيونات بشكل فعال. يمكن أن يؤدي هذا إلى تفاعلات أيون ثنائي القطب بين الأملاح وأنواع روابط الهيدروجين التي تكون أكثر ملاءمة من روابط الهيدروجين العادية. [مصدر]

الإيثانول ، مثل Guanidine HCL ، هو عامل متشابك. يضاف الإيثانول لسببين:

  1. تعزيز والتأثير على ارتباط الأحماض النووية بالسيليكا.

    • تتداخل مع القوى غير التساهمية داخل الجزيئية كما هو موضح أعلاه.

    • تقليل ارتباط الأحماض النووية بالماء. من Melzak وآخرون. (1996):

      إن تقليل النشاط المائي في المحلول من خلال إضافة إما ملح شوتروبيك أو كحول يغير البنية الحلزونية لـ B-DNA إما بشكل مستمر إلى C-DNA أو من خلال انتقال تعاوني حاد إلى A-DNA (28). ويصاحب أي من الانتقال انخفاض في مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بواسطة المذيبات.

  2. يسمح التركيز الصحيح بغسل الأملاح من الغشاء. [مصدر].


اقتباسات

  • Melzak et al. (1996) القوى الدافعة لامتصاص الحمض النووي للسيليكا في محاليل البركلورات. J. علوم واجهة الغروانية. 181: 635 - 644.

في عالم اليوم لتحليل الحمض النووي عن طريق تعدد الإرسال و PCR في الوقت الفعلي ، لا يمكن التقليل من أهمية جودة الحمض النووي المنقى. يعد العثور على نظام عزل الحمض النووي المناسب لتلبية احتياجات التطبيقات النهائية أمرًا حيويًا لإكمال التجارب بنجاح.

يتناول دليل تنقية الحمض النووي هذا المعلومات العامة حول أساسيات استخلاص الحمض النووي وإعداد البلازميد وتقدير الحمض النووي ، وكذلك كيف يمكن لتقنيات التنقية المُحسَّنة أن تساعد في زيادة إنتاجيتك ، بحيث تقضي وقتًا أقل في تنقية الحمض النووي والمزيد من الوقت في تطوير التجارب وتحليل البيانات.

بالإضافة إلى ذلك ، يغطي هذا الدليل مجموعة متنوعة من منتجات Promega المتاحة لتنقية منتجات الجينوم والبلازميد والشظايا / PCR. جنبًا إلى جنب مع مناقشة أنظمة استخراج الحمض النووي من Promega ، فإننا نأخذ في الاعتبار أيضًا قضايا قابلية التوسع والنقاء والعائد والتأثيرات التي تحدثها على التطبيقات النهائية للمساعدة في العثور على أفضل نظام يلبي احتياجاتك.


مقدمة

تم استخدام عزل DNA البلازميد للاستنساخ وتعبير البروتين لعقود من الزمن [1-3] ولا يزال أحد أكثر الطرق شيوعًا التي يستخدمها علماء الأحياء الجزيئية. تتضمن تنقية البلازميد خطوتين: التحلل البكتيري وعزل الحمض النووي. غالبًا ما يتم إجراء التحلل البكتيري من خلال التحلل القلوي ، وهي طريقة سريعة وفعالة لفصل البروتين والحمض النووي الجيني عن البلازميدات الصغيرة [3]. ومع ذلك ، لعزل DNA البلازميد ، تتوفر عدة طرق.

مجموعات تحضير البلازميد التجارية تقلل الوقت والعمالة. يعتبر عزل DNA البلازميد عبر أعمدة السليكا الدورانية الطريقة القياسية حاليًا [4 ، 5]. يُعتقد أن هذه تعتمد على قدرة "أملاح Chaotropic" على تجفيف الحمض النووي ، مما يسمح للحمض النووي بالارتباط بشكل عكسي بالسيليكا عبر مجموعات الفوسفات الخاصة به [6 ، 7]. ومع ذلك ، تتطلب الأطقم عالية الإنتاجية استثمارًا كبيرًا للوقت عند مقارنتها بالمجموعات ذات الإنتاجية المنخفضة (الجدول 1 ، Maxiprep مقابل Miniprep). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييد إنتاجية الحمض النووي بحجم العمود ، نظرًا لأن أعمدة السيليكا تربط كميات محدودة من DNA البلازميد [4]. وهكذا ، يعلن المصنعون تقليديًا عن مجموعة عزل البلازميد الخاصة بهم بالكمية القصوى من الحمض النووي التي يمكن ربطها بعمود (الجدول 1). ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه التقديرات لا تأخذ في الاعتبار حجم البلازميد أو نوعه أو عدد النسخ أو ظروف نمو السلالة البكتيرية أو السلالة البكتيرية نفسها. من المعروف أن كل هذه العوامل تؤثر على إنتاجية الحمض النووي.

تم استخدام ترسيب DNA البلازميد عبر الإيثانول أو الأيزوبروبانول ، والذي يعطل فحص الشحنة بالماء ويسمح للأيونات الموجبة في المحلول بالتفاعل مع مجموعات فوسفات الحمض النووي ، بشكل شائع قبل تطوير أعمدة السيليكا. على الرغم من انخفاض التكلفة ، إلا أن خطوات الترسيب والطرد المركزي وغسيل الحبيبات تتطلب وقتًا طويلاً حتى بالنسبة للمستحضرات الصغيرة الحجم ، وتتطلب مجموعات الإنتاج العالية ثقافات بكتيرية أكبر حجمًا ووقتًا أطول. ومن المثير للاهتمام ، أن مخازن الربط والغسيل لبعض أعمدة السليكا الدورانية التجارية تشتمل أيضًا على الكحولات (مثل الإيثانول في عازلة الغسيل QIAprep Miniprep PE [8]) ، والتي مثل الأملاح المتباعدة يمكن أن تزيد من تفاعل الحمض النووي مع مصفوفة السيليكا.

نحن هنا نُبلغ عن بروتوكول معدل لعزل غلة الحمض النووي البلازميد المرتفع في الوقت والعمالة المخفضين بشكل كبير ، وهو ما نسميه Miraprep.


الخلفية: مثيلة محفز الحمض النووي هي توقيع لإسكات الجينات الكابتة للورم. تشتمل الطرق الأكثر استخدامًا للكشف عن مثيلة الحمض النووي على 3 عمليات منفصلة ومستقلة: استخراج الحمض النووي ، وتحويل ثنائي كبريتيت ، واكتشاف المثيلة عبر طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة (MSP). تتضمن هذه الطريقة العديد من الخطوات غير المتصلة مع الخسائر المرتبطة بالمواد ، مما قد يقلل من الحساسية التحليلية المطلوبة لتحليل العينات السريرية الصعبة.

الطريقة: المثيلة على الخرز (MOB) هي تقنية جديدة تدمج استخراج الحمض النووي ، وتحويل بيسلفيت ، و PCR في أنبوب واحد عبر استخدام خرزات السيليكا الفائقة المغناطيسية (SSBs) كحامل DNA مشترك لتسهيل إزالة الحطام الخلوي وتبادل المخزن المؤقت في جميع أنحاء العملية برمتها. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام المخزن المؤقت PCR لإزالة الحمض النووي المعالج بثنائي كبريتيت مباشرة من SSBs لتضخيم الهدف اللاحق. تم تقييم الحساسية التشخيصية لـ MOB عن طريق تحليل المثيلة لـ CDKN2A [مثبط كيناز 2A المعتمد على السيكلين (الورم الميلانيني ، p16 ، يثبط CDK4) المعروف أيضًا باسم ص 16 INK4a ] محفز في مصل الحمض النووي لمرضى سرطان الرئة ومقارنته بالطرق التقليدية.

النتائج: تم إجراء تحليل المثيلة المكون من استخلاص الحمض النووي متبوعًا بتحويل ثنائي كبريتيت و MSP بنجاح خلال 9 ساعات في أنبوب واحد. كان متوسط ​​إنتاجية DNA قبل PCR أعلى 6.61 مرة باستخدام تقنية MOB مقارنة بالتقنيات التقليدية. علاوة على ذلك ، زاد MOB من حساسية التشخيص في تحليلنا لـ CDKN2A محفز في مصل المريض من خلال الكشف الناجح عن المثيلة في 74٪ من مرضى السرطان ، مقابل معدل الكشف البالغ 45٪ الذي تم الحصول عليه بالتقنيات التقليدية.

الاستنتاجات: نجحت تقنية MOB في دمج 3 عمليات في أنبوب واحد ، مما يتيح سهولة المعالجة وزيادة إنتاجية الكشف. سمحت زيادة عائد ما قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل في MOB باكتشاف مثيلة فعال وحساس من الناحية التشخيصية.

التغييرات اللاجينية الأكثر تميزًا هي الإسكات الوراثي للجينات الكابتة للورم (TSGs) 2 بواسطة فرط ميثيل الحمض النووي CpG الشاذ لمحفزاتها (1) (2). يشبه تأثير مثيلة المحفز هذا الطفرات الجينية لفقدان الوظيفة وقد لوحظ في TSGs جيدة التوصيف التي تسبب أشكالًا موروثة من السرطان عندما تتحور في أحداث السلالة الجرثومية (3) (4) (5). نظرًا لأن تعطيل الجينات المعتمد على المثيلة يمكن أن يحدث مبكرًا جدًا أثناء تطور السرطان ، حتى قبل ملاحظة الطفرات ، فقد يكون اكتشاف مثيلة الحمض النووي مفيدًا للكشف المبكر عن السرطان (6) (7) (8). في السنوات الأخيرة ، تم تصميم العديد من الأساليب لاكتشاف وتمييز التسلسلات الميثيلية في الأنسجة غير المرضية والأنسجة السرطانية. استندت طرق الجيل الأول في المقام الأول على استخدام إنزيمات التقييد الحساسة للميثيل متبوعة بالنشاف الجنوبي (9). تتضمن طرق الجيل الثاني مناهج تركز إما على اكتشاف المناطق التي يتم ميثيلها تفاضليًا في الأنسجة غير المرضية والسرطانية أو تحليل ملف تعريف المثيلة لـ TSGs المرشحة (8) (10) (11). يمكن تصنيف هذه التقنيات على نطاق واسع إلى (أ) طرق اكتشاف CpG ، بما في ذلك PCR (MSP) الخاص بالمثيلة ، و MSP الكمي ، و MSP المتداخلة (ب) تحليل مفصل لأنماط محددة من مثيلة CpG ، كما هو الحال في تسلسل بيسلفيت ، على سبيل المثال و (ج) مقاربات على مستوى الجينوم تستخدم الاكتشاف القائم على المصفوفة ، مثل نظام Illumina (12) ، أو تحليلات التعبير الجيني لتحديد الجينات التي يتم التعبير عنها عند عكس التعديلات اللاجينية بواسطة العوامل الدوائية (13). تتضمن معظم هذه الطرق استخراج الحمض النووي متبوعًا بتحويل ثنائي كبريتيت الصوديوم (14) لقالب الحمض النووي المحوَّل الصفات. يتضمن استخلاص الدنا التقليدي تحللًا كيميائيًا للخلايا يتبعه استخلاص الفينول والكلوروفورم وترسيب الإيثانول (PC) ، الأمر الذي يتطلب كلاً من الطرد المركزي والتجفيف بالهواء (15). يخضع الحمض النووي المستخرج بعد ذلك لتحويل ثنائي كبريتيت الصوديوم ، والذي يتطلب تمسخ الحمض النووي الجيني ، ونزع الأمين من السيتوزينات غير الميثيل مع تركيز عالٍ من بيسلفيت الصوديوم ، وإزالة السلفونات بقاعدة قوية. تتطلب درجة الحرارة ودرجة الحموضة وتركيز الملح معايرة دقيقة ، والوقت الموصى به للتحويل الفعال للبيسلفيت هو 12-16 ساعة (11). تعد إنتاجية وجودة الحمض النووي العالية ، فضلاً عن الكفاءة المناسبة في معالجة بيسلفيت ، من المتطلبات الأساسية لهذه التقنيات لتعمل بشكل جيد.

بالنظر إلى هذه الخطوات المتعددة ، تعد الطرق التقليدية شاقة نسبيًا مقارنة بطرق استخراج الحمض النووي على ركيزة صلبة ، حيث يرتبط الحمض النووي بسطح السيليكا في محاليل تحتوي على أملاح تشوتروبيك ، مثل تلك الموجودة في اليوديد أو البيركلورات (16). على الرغم من أن طرق الركيزة الصلبة قد تم تنفيذها لتبسيط العملية ، إلا أن تحليل المثيلة لا يزال عملية مفككة يتم فيها استخراج الحمض النووي ، وتحويل بيسلفيت ، و PCR في أنابيب منفصلة. تعالج تقنية المثيلة على الخرز (MOB) هذه المشكلة كطريقة للكشف عن المثيلة أحادية الأنبوب (انظر الشكل 1 في ملحق البيانات المصاحب للإصدار عبر الإنترنت من هذا الاتصال الموجز على http://www.clinchem.org / content / vol56 / issue6). يبدأ MOB بمحلول الخلية أو عينات المريض الممزوجة بحبيبات السيليكا الفائقة المغناطيسية (SSBs) (17) في محلول Chaotropic لـ Guanidine HCl في محلول حامض الستريك ، مما يعزز ربط الحمض النووي بـ SSBs. تبقى الجزيئات الكبيرة الأخرى وحطام الخلية غير المقيدة في المحلول ، والتي يتم إزالتها بعد ذلك عن طريق استخراج المرحلة السائلة. مطلوب خطوات غسيل إضافية بالكحول لضمان نقاء الحمض النووي الكافي للتحليل اللاحق. يتم بعد ذلك استخلاص الحمض النووي المرتبط في مخزن مؤقت ذي قوة أيونية منخفضة واستخدامه للخطوة التالية في هذه العملية (انظر الجدول 1 والطرق التكميلية في ملحق البيانات عبر الإنترنت). يمكن إكمال بروتوكول MOB في 9 ساعات ، من عزل الحمض النووي إلى تحليل المثيلة باستخدام MSP أو MSP الكمي أو نقل طاقة الرنين بالرنين الكمي المحدد (MS-qFRET) (18).

يعود تعزيز عائدات DNA قبل PCR مع MOB إلى مجموعة من العمليات. تسمح مساحة السطح الكبيرة لـ SSBs بالتقاط كميات كبيرة من الحمض النووي ، وتقليل خطوات الغسيل / الربط يقلل من فقدان الحمض النووي في كل خطوة ، وتقلل المعالجة أحادية الأنبوب من فقد الحمض النووي الذي يحدث أثناء عمليات نقل الأنبوب. يمثل إنتاج الحمض النووي غير الكافي تحديًا لتطوير أنظمة الكشف عن العلامات الحيوية المعتمدة على الدم. لتوضيح ميزة عملية الأنبوب الواحد ، قمنا بمقارنة العائد المسبق للكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل والكشف عن المثيلة بنهج MOB مع فحص تحويل PC / ثنائي كبريتات / MSP التقليدي. أجرينا تحليلًا مقارنًا تمثيليًا مع 15 عينة مصل من مرضى سرطان الرئة (7 مرضى من المرحلة الأولى ، و 3 من المرحلة الثانية ، و 5 من مرضى المرحلة الثالثة) (الشكل 1). كان الاسترداد باستخدام MOB أكبر من تحويل PC / bisulfite لكل عينة مصل مريض (متوسط ​​زيادة ، 6.61 ضعفًا). كانت عوائد الاستخراج أعلى باستخدام طريقة MOB مقارنة بالمجموعات التجارية المخصصة لاستخراج الحمض النووي (انظر الشكل 2 أ في ملحق البيانات عبر الإنترنت). تم تمديد التحليل ليشمل 10 عينات أخرى ، بما في ذلك الأنسجة الطازجة والأنسجة المضمنة بالبارافين من المرضى الأصحاء ، وأنسجة الورم الجديدة من مرضى السرطان ، وعينات البلغم. تم الحصول على زيادات في متوسط ​​إنتاجية الحمض النووي بمقدار 7.8- و 5.3- و 6.4- و 7.5 أضعاف ، على التوالي ، باستخدام MOB ، مقارنة بطريقة التحويل التقليدية PC / bisulfite (انظر الشكل 2 ب في ملحق البيانات عبر الإنترنت).

إنتاج DNA قبل PCR من مصل الدم لطريقة MOB وطريقة تحويل PC / bisulfite التقليدية.

تم تطبيع الغلة لإدخال 25 ميكرولتر من المصل.

إنتاج DNA قبل PCR من مصل الدم لطريقة MOB وطريقة تحويل PC / bisulfite التقليدية.

تم تطبيع الغلة لإدخال 25 ميكرولتر من المصل.

بصرف النظر عن كونها عملية أحادية الأنبوب ، تتمتع هذه التقنية بميزة فريدة تجمع بين نزع الأمين وإزالة الكبريت ، وهو تبسيط من النهج التقليدي ، والذي يتطلب خطوات ربط وغسيل بين هاتين العمليتين. يؤدي تقليل عدد خطوات الربط والغسيل إلى زيادة إنتاجية الحمض النووي وتقليل وقت الفحص (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم التقنية SSBs داخل الأنبوب لكل من عملية تحويل ثنائي كبريتيت و PCR. لإثبات أن وجود SSBs لا يعيق تحويل ثنائي كبريتيت ، استخدمنا MSP في الوقت الفعلي لتقييم CDKN2A 3 [مثبط كيناز 2A المعتمد على السيكلين (الورم الميلانيني ، p16 ، يثبط CDK4) المعروف أيضًا باسم ص 16 INK4a ] مثيلة المروج. قمنا بتقييم 5 تفاعلات ثلاثية مع إدخال الحمض النووي من فترات مختلفة من معالجة بيسلفيت (0 ، 1 ، 3 ، 4 ، 8 ساعات) وقارننا النتائج مع تلك الخاصة بالسيطرة ، والتي استخدمت 16 ساعة من العلاج التقليدي ثنائي كبريتيت (انظر الطرق التكميلية في ملحق البيانات عبر الإنترنت). تشير النتائج إلى أن 4 ساعات من معالجة بيسلفيت كافية للتحويل وأن وجود الخرز لا يغير عملية التحويل (انظر الشكل 3 في ملحق البيانات عبر الإنترنت). علاوة على ذلك ، فإن القدرة على توليد نتائج مثيلة كمية دقيقة في الوقت الحقيقي ومنتجات PCR قابلة للتكرار توضح أيضًا أن الخرزات ليست ضارة بـ PCR.

لا تزال مصادر الحمض النووي في مصل الدم غير معروفة ولكن من المحتمل أن تشمل كلاً من الخلايا السرطانية المنتشرة والحمض النووي الحر المنطلق من كتل الورم. لذلك يمكن أن يكون تقييم المثيلة في المصل أو البلازما أداة مفيدة للكشف المبكر عن السرطان. وقد أظهرت العديد من الدراسات تعطيل المرتبط بفرط الميثيل CDKN2A كحدث مبكر ومتكرر في سرطانات الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة (سرطان الخلايا الحرشفية ، 60٪ -80٪ ​​سرطان غدي ، 30٪ -45٪) وأنواع أخرى من السرطان (19) (20) (21). على الرغم من أن معظم هذه الدراسات قد استخدمت MSP كأداة تحليلية لتقييم مثيلة الجينات ، فإن توسيع مثل هذا التحليل ليشمل الاختبارات المعتمدة على الدم والمصل القابلة للاستخدام سريريًا كان محدودًا بسبب نقص حساسية الطرق السابقة. لمعالجة ما إذا كان تحسين إنتاجية الحمض النووي يمكن أن يؤثر على اكتشاف المثيلة ، قمنا بمقارنة MOB ونهج PC / bisulfite / MSP التقليدية في دراسة معماة لتقييم مثيلة من CDKN2A مروج في 49 عينة مصل مريض (18 عينة غير مرضية و 31 عينة سرطانية). تم اختيار عينات الورم الـ 31 مسبقًا من المرضى الذين تم تشخيصهم بسرطان الرئة والذين أظهروا أيضًا CDKN2A مثيلة المروج في الأورام المقابلة. تم وصف المواد الأولية والأساليب المستخدمة بالتفصيل في الطرق التكميلية والجدول 2 من ملحق البيانات عبر الإنترنت. بينما CDKN2A تم اكتشاف المثيلة في 14 من 31 مريضًا بسرطان الرئة باستخدام تقنية PC / bisulfite / MSP التقليدية ، وكانت طريقة MOB قادرة على اكتشاف CDKN2A المثيلة في 23 من هؤلاء 31 مريضًا (انظر الجدول 3 في ملحق البيانات عبر الإنترنت).

عندما تحتوي العينات المستخدمة لتحليل المثيلة على كميات كبيرة من الحمض النووي (مثل خطوط الخلايا والأورام وما إلى ذلك) ، قد يكون التحليل أحادي الأنبوب لكامل كمية الإدخال غير ضروري ، ومع ذلك ، يسمح MOB بتخزين الحمض النووي المستخرج أو ثنائي سلفيت - الحمض النووي المعالج ، والذي يمكن استخدامه لاحقًا للتحليلات النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تفاعلات متعددة بالتوازي مع نهج MOB لأنه يسمح بالتقسيم المباشر للخرز المغناطيسي إلى عدة أنابيب. اختبرنا طريقة MOB باستخدام خط خلايا سرطان القولون والمستقيم RKO وحصلنا على عائدات من الحمض النووي المستخرج من 20-60 ميكروغرام. بعد تقسيم الحمض النووي المرتبط بـ SSB إلى 10 أنابيب مختلفة ، لا يزال لدينا مادة كافية لتحليل MSP الناجح لـ CDKN2A, CDKN2B [مثبط كيناز 2B المعتمد على السيكلين (p15 ، يثبط CDK4)] ، و بطاقة PYCARD (يحتوي نطاق PYD و CARD المعروف أيضًا باسم ASC و TMS1) المروجين (البيانات غير معروضة).

يجب أن يكون نظام تحليل المثيلة أحادي الأنبوب المشغّل مغناطيسيًا مع SSBs آليًا ومتوافقًا مع الروبوتات المتاحة التجارية التي تستخدم الالتقاط المغناطيسي ، لأنه يتم سحب الكواشف داخل وخارج الأنبوب الفردي بطريقة مماثلة ولأن عمليات الربط والشطف متسقة. يعمل إدخال SSBs على تبسيط معالجة العينات وتجاوز استخدام نقل السائل ، والتجفيف بالهواء ، والطرد المركزي ، ويزيد الغلة مقارنة بالطرق التقليدية. لا تعيق SSBs الموجودة في الأنبوب تحويل ثنائي كبريتيت ، MSP ، أو طرق أخرى [بما في ذلك MS-qFRET (18)] ، وهي ميزة يمكن أن تعزز الحساسية التحليلية من خلال الاكتشاف القائم على تكنولوجيا النانو (انظر الشكل 4 في ملحق البيانات عبر الإنترنت ). يمكن أن يؤدي تقليل خطوات الربط والغسيل عن طريق الجمع بين نزع الأمين وإزالة الكبريت إلى زيادة تحسين الكفاءة. بالنظر إلى أن العملية يمكن أن تكتمل في أقل من 9 ساعات ، فإن الطريقة تقدم طريقة قابلة للتطبيق للتنفيذ السريري لتحليل المثيلة.

ساهم هؤلاء المؤلفين بالتساوي على هذا العمل

الاختصارات غير القياسية: TSG ، MSP لجين مثبط الورم ، PCR PCR الخاص بالميثيل ، واستخراج الفينول والكلوروفورم وترسيب الإيثانول MOB ، والمثيلة على الخرز SSB ، وحبة السيليكا الفائقة المغناطيسية MS-qFRET ، ونقل طاقة رنين نقطة الكم الخاصة بالمثيلة.

الجينات البشرية: CDKN2A ، مثبط كيناز 2A المعتمد على السيكلين (الورم الميلانيني ، p16 ، يمنع CDK4) مثبط كيناز 2B المعتمد على السيكلين CDKN2B (p15 ، يمنع CDK4) يحتوي على مجال PYCARD و PYD و CARD.

الكاتب الاشتراكات:أكد جميع المؤلفين أنهم ساهموا في المحتوى الفكري لهذه الورقة واستوفوا المتطلبات الثلاثة التالية: (أ) مساهمات كبيرة في التصور والتصميم ، واكتساب البيانات ، أو تحليل البيانات وتفسيرها (ب) صياغة أو مراجعة المقال للمحتوى الفكري و (ج) الموافقة النهائية على المقال المنشور.

إفصاحات المؤلفين عن تضارب المصالح المحتمل:عند تقديم المخطوطة ، أكمل جميع المؤلفين نموذج الإفصاح عن تضارب المصالح المحتمل. تضارب المصالح المحتمل:

العمل أو القيادة: لم يصرح بشيء.

دور استشاري أو استشاري: س. Baylin و Oncomethylome Sciences و BioNumerik Pharmaceuticals و Constellation Pharmaceuticals و Syndax Pharmaceuticals J.G. هيرمان ، علوم Oncomethylome.

ملكية الأسهم: س. بايلن ، علوم Oncomethylome.

الأتعاب: س. Baylin و Oncomethylome Sciences و Constellation Pharmaceuticals و BioNumerik Pharmaceuticals.

تمويل البحوث: في. Bailey و Hodson Trust و Siebel Scholars Foundation M. Brock ، Oncomethylome Sciences S.B. Baylin و Oncomethylome Sciences و BioNumerik Pharmaceuticals والمعهد الوطني للسرطان يمنح SPORE CA058184 و R21-CA120742–01 ومؤسسة العلوم الوطنية تمنح 0546012 و 0730503 و 0725528 والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية ج. هيرمان ، علوم Oncomethylome.

شهادة خبير: لم يصرح بشيء.

دور الراعي: لم تلعب المنظمات الممولة أي دور في تصميم الدراسة أو اختيار المرضى المسجلين أو مراجعة البيانات وتفسيرها أو إعداد المخطوطة أو الموافقة عليها.


استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة qiagen - (23 مايو 2013)

الآن أتساءل ما هي المخازن المؤقتة ATL و AL.
أيضا المخزن المؤقت AW1 و AW2.

ما وجدته حتى الآن هو:
ATL: تحلل الأنسجة الحيوانية. هذا أمر واضح ومباشر وأنا أفهم هذا.
AL: هنا هو المكان الذي أشعر فيه بالارتباك = & gt لقد وجدت (googling) أنها مخزن مؤقت لتحلل الخلايا؟ لكن لماذا أحتاج إلى محلول تحلل آخر؟ ألا يتم استخدام ATL في الأنسجة والخلايا؟ أو؟

AW1: يستخدم لإفساد البروتينات حتى تتمكن من المرور عبر الفلتر
AW2: 70٪ إيثانول لغسل الأملاح. كما أنه يحتوي على مركز qiagen .. ولكن لا توجد فكرة عما يعنيه ذلك ..

أي أفكار حول هذا المخزن المؤقت AL؟

بادئ ذي بدء ، لا أعتقد أنه من الضروري حقًا تكوين مخازن QIAGEN المؤقتة ، طالما أنها تعمل من أجلك. العديد منهم ملكية على أي حال.

من ما وجدت AL buffer الذي يحتوي على أملاح guanidine لتحسين ربط العمود والمنظفات.

AW1 و 2 عبارة عن مخازن للغسيل يتم توفيرها كمركزات ، ويحتوي AW1 على غسيل صارم بتركيز منخفض من كانيدين و AW2 عبارة عن محلول إيتانول قائم على Tris لإزالة الأملاح.

قال Trof في الخميس 23 مايو 19:26:24 2013:

بادئ ذي بدء ، لا أعتقد أنه من الضروري حقًا تكوين مخازن QIAGEN ، طالما أنها تعمل من أجلك. كثير منهم ملكية على أي حال.

من ما وجدت AL buffer الذي يحتوي على أملاح guanidine لتحسين ربط العمود والمنظفات.

AW1 و 2 عبارة عن مخازن للغسيل يتم توفيرها كمركزات ، ويحتوي AW1 على غسيل صارم بتركيز منخفض من كانيدين و AW2 عبارة عن محلول إيتانول قائم على Tris لإزالة الأملاح.

أستطيع أن أفهم ، لكنني أتساءل ما الفرق بين المخزن المؤقت لتحلل الأنسجة (ATL) والمخزن المؤقت للتحلل (AL).
يبدو من الغريب استخدام اثنين من المحاليل المنظمة للتحلل.

ليس صحيحا. إذا كنت & # 39d تقوم بالعزل بنفسك ، فمن المحتمل أن تستخدم محلول تحلل محدد لكل حالة ، ولكن يمكن للمجموعة التجارية & # 39t النفايات المخازن المؤقتة التي لن تستخدمها & # 39t. لذلك قاموا بصنعه باستخدام محلول واحد ضروري لجميع الأغراض ومن المحتمل أن يكون أقوى للأنسجة فقط.
تم تحسين بروتوكولات الأدوات التجارية لطريقة وعرض استخدامها ، والتي قد تبدو أقل صرامة من وجهة نظر ممارسة معملية شائعة.

FYI the Qiagen ATL buffer هو أساسًا SDS ، ويعمل على تدمير نشاط نوكلياز دون الإضرار ببروتيناز K (PK) كثيرًا ، ومساعدة بروتينات PK على هضم. & # 160 يمكنك إضافة 5-10mM CaCl2 لمساعدة PK وربما تتبع EDTA (

2mM) لسحب Mg2 + من نوكليازات لكن 2-5٪ SDS plus PK تهدم البروتين (والهيموغلوبين في الدم) بينما يموت نوكلياز. & # 160RNAase A سيموت بالمثل. ATL هو أيضًا درجة الحموضة 8.6 (من المحتمل تريس) ويبدو أنه مشابه لمخزن الهضم "طرف الذيل". & # 160AL إضافة (

4M GuHCl) & # 160 البروتين المهضوم في محلول ثم إضافة ETOH (إلى

33٪) يساعد في الحفاظ على SDS في المحلول لأنه يميل إلى التعجيل مع GuHCl.


طرق استخلاص الحمض النووي

يمكن وصف طرق الاستخراج النووي على نطاق واسع إلى نوعين مختلفين:

الأساليب القائمة على الحلول

اعتمدت العديد من الطرق المبكرة لاستخراج الحمض النووي على طحن العينات البيولوجية المجمدة ، ثم مزجها مع محاليل المواد الكيميائية المصممة لتيسير تنقية الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي.

1. الطرد المركزي المتدرج لكلوريد السيزيوم (مع بروميد الإيثيديوم)

تعتمد هذه الطريقة على ظاهرة الطفو والكثافة النوعية. كلوريد السيزيوم (CsCl) ملح كثيف للغاية. عندما تتعرض محاليل هذا الملح للطرد المركزي بسرعات عالية جدًا (نموذجيًا و GT100000 دورة في الدقيقة) ، يُنشئ CsCl تدرج تركيز ، حيث يتركز بدرجة عالية في أحد طرفي أو جانب أنبوب الطرد المركزي الذي هو & # 8217s فيه ، وأقل تركيزًا على الآخر. إذا تم إنهاء عملية الطرد المركزي بلطف ، مع تباطؤ جهاز الطرد المركزي ببطء ، فإن المحلول الأكثر كثافة (مع تركيز أعلى من CsCl) سوف يستقر في قاع الأنبوب ، مع الحفاظ على تدرج التركيز لبعض الوقت. الجزيئات الأخرى الذائبة في المحلول ستفصل نفسها وفقًا لمدى كثافتها ، مع انتقال الجزيئات الأكثر كثافة نحو قاع الأنبوب ، والجزيئات الأقل كثافة تتحرك نحو الأعلى. عندما يكون الحمض النووي في وجود جزيء يسمى بروميد إيثيديوم ، فإنه سوف يرتبط به ويصبح مشعًا عندما يكون تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يضبط بروميد الإيثيديوم أيضًا كثافة الحمض النووي بحيث يتحرك نحو مركز الأنبوب عند الطرد المركزي. ستنتقل الملوثات إلى مواقع مختلفة ، وبالتالي سيتم فصلها عن الحمض النووي ، والذي يمكن رؤيته واستعادته بسهولة لأنه سيكون متوهجًا. ستفصل الخطوات اللاحقة بعد ذلك الحمض النووي عن CsCl وبروميد الإيثيديوم. هذه التقنية فعالة بشكل خاص لفصل البلازميدات & # 8211 وهي سلاسل DNA صغيرة تستخدمها البكتيريا لمشاركة المعلومات حول مقاومة المضادات الحيوية مع بعضها البعض ، والحمض النووي للميتوكوندريا ، وجزيئات الحمض النووي الأخرى المحددة التي ترتبط بكميات مميزة من بروميد الإيثيديوم ، وبالتالي سوف لها كثافة فريدة. من السهل فصل الحمض النووي للميتوكوندريا والبلازميد. يتم ترتيب هذه الأحماض النووية في أنماط دائرية ملفوفة للغاية (تسمى فائقة الالتفاف). يرتبط الحمض النووي غير الملفوف (مثل أنواع الحمض النووي الصبغية الأطول) بكميات مختلفة من بروميد الإيثيديوم ، وله كثافة مختلفة & # 8211 مما يسهل فصلها عن DNA البلازميد.

2. غوانيدينيوم ثيوسيانات - فينول - كلوروفورم استخراج الحمض النووي

يسمح محلول مائي من ملح غوانيدينيوم ثيوسيانات ، عند مزجه مع المذيبات الفينول والكلوروفورم ، بتنقية RNA بفعالية من خلال عدد قليل من الخطوات. عندما يتم طحن العينات وخلطها مع الكلوروفورم والفينول وخلات الصوديوم وجوانيدينيوم ثيوسيانات ، وتعريضها للطرد المركزي ، سينفصل محلول الملح عن المذيبات & # 8211 لتوفير طور مائي علوي وطور عضوي سفلي يتكون من المذيبات. سيبقى الحمض النووي الريبي في الطور المائي ، بينما تنتقل البروتينات والأحماض النووية الأخرى والملوثات الأخرى إلى المرحلة العضوية أو إلى الواجهة بين المرحلتين.

3. استخراج الحمض النووي Cetyltrimethylammonium بروميد

تستخدم هذه التقنية في الغالب لعينات النباتات وكذلك أجزائها مثل الحبوب والبذور والأوراق. كما أنها تستخدم في العديد من عينات الطعام. الأحماض النووية وبعض السكريات الأخرى غير قابلة للذوبان في محاليل 2٪ من استخلاص الحمض النووي بروميد سيتيل ترايميثيل الأمونيوم (CTAB) ، عند درجة حموضة عالية. السكريات والبروتينات المحايدة قابلة للذوبان. يوفر هذا طريقة سهلة لإزالة العديد من الملوثات النباتية الصعبة قبل مزيد من التنقية.

4. استخراج Chelex®

تستخدم هذه التقنية في مجال الطب الشرعي لاستخراج الحمض النووي من مصادر مختلفة مثل مسحات الشدق وبطاقات الدم والشعر. تستخدم هذه الطريقة الراتنج (تجارة تسمى Chelex®، التي ترتبط بالمثبطات الشائعة لعملية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). ينتج عن هذا عينة خام إلى حد ما ، ولكنها تحافظ على الحمض النووي وتجعله مفيدًا لتحليل الطب الشرعي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل.

5. استخراج القلوية

تُستخدم هذه التقنية لعزل DNA البلازميد ، بمفردها لتحضيرات خام نسبيًا ، أو كخطوة أولى في جميع عمليات تنقية البلازميد تقريبًا. إنه ينطوي على حصاد البكتيريا ذات الأهمية من وسط الاستزراع وبالتالي تعريض البكتيريا لمحلول قلوي للغاية. يتبع ذلك عمومًا خلط المستخلص القلوي مع المنظف Sodium Dodecyl Sulfate ، الذي يزيل البروتينات ومعظم الملوثات الأخرى. تتمثل إحدى أكبر مزايا هذه الطرق في أنه نظرًا لوجود العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الصبغي الكبير ، تتم إزالة هذا الحمض النووي جنبًا إلى جنب مع البروتينات. نظرًا لأن تقنيات الاستنساخ الجزيئي تعتمد على معالجة DNA البلازميد ، فإن إزالة الحمض النووي الصبغي أمر بالغ الأهمية.

استخراج الحمض النووي في المرحلة الصلبة

تعمل طرق استخلاص الطور الصلب عن طريق التسبب في ارتباط الأحماض النووية بالدعامات الصلبة ، مثل الحبيبات المغناطيسية المطلية بالسيليكا أو المواد الأخرى. ثم يتم غسل الحبيبات (أو الدعامات الأخرى) بالكحول لإزالة الملوثات. يتم بعد ذلك غسل الدعامة بسائل يجعل الأحماض النووية قابلة للذوبان مرة أخرى ، مما يحرر الحمض النووي من الدعم في عملية تعرف باسم الشطف. طريقة بسيطة هي إضافة محلول يحتوي على Chaotrope إلى مستخلص الحمض النووي الخام. عوامل Chaotropic هي جزيئات تعطل شبكة الترابط الهيدروجيني بين جزيئات الماء. في وجود Chaotropes ، فإن الأحماض النووية أقل قابلية للذوبان بكثير وسوف ترتبط بالزجاج والخرز المغناطيسي المطلي بالسيليكا وغيرها من الدعامات الصلبة & # 8211 مما يسهل فصلها عن الملوثات. يمكن أن تعتمد طرق استخراج المرحلة الصلبة أيضًا على الارتباط الانتقائي للحمض النووي والحمض النووي الريبي براتنجات التبادل الأيوني أو مواد كيميائية أخرى.


بيريميدين

Pyrimidines هي مركبات عطرية غير متجانسة ، لها بنية جزيئية مماثلة لجزيئات بيريدين. يندرج تحت فئة الديازينات ، وهي حلقات بنزين تحتوي على ذرتين نيتروجين. تُظهر البيريميدين وجود ذرات النيتروجين في الموضعين 1 و 3 من هيكل الحلقة. هناك نوعان من بيريميدينات في شكل قواعد الحمض النووي.

سيتوزين

اسم IUPAC الكيميائي للسيتوزين هو 4-aminopyrimidin-2 (1H) -one. هو مشتق بيريميدين مع بدائل مجموعة أمين في 4 ومجموعة كيتو في موقعين. تم اكتشافه لأول مرة من أنسجة العجل الغدة الصعترية ، بواسطة ألبريشت كوسيل وألبرت نيومان في عام 1894. تم العثور عليه في الحمض النووي باعتباره نيوكليوتيد ، السيتيدين. ينتج عن مثيلة السيتوزين 5-ميثيل سيتوزين ، في حين أن الهيدروكسيل ينتج عنه 5-هيدروكسي ميثيل سيتوزين. يحدث في الحمض النووي مثل ديوكسيتيدين ثلاثي الفوسفات (dCTP).

ثايمين

اسم IUPAC الكيميائي للثيمين هو 5-Methylpyrimidine-2،4 (1H ، 3H) -dione. يتكون من مثيلة جزيء اليوراسيل عند الكربون الخامس. تم اكتشافه جنبًا إلى جنب مع السيتوزين ، بواسطة Kossel و Neumann. يشكل النوكليوتيدات ، الثيميدين. في وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، تشكل هذه القاعدة ثنائيات بين جزيئين ثيميدين متجاورين على طول حبلا الحمض النووي. يحدث في الحمض النووي مثل ديوكسي ثيميدين ثلاثي الفوسفات (dTTP).


الإيثانول مذيب جيد

Both ethanol and isopropanol mix well (are miscible with) water, but they have lower dielectric constants than water, meaning that their ability to shield positive and negative charges in the solution and keep them segregated is much poorer. The dielectric constant for water, for example, is 78.5, while the constant for ethanol is 24.3. DNA is negatively charged, so it's attracted to positive ions in the solution like potassium or sodium. Ethanol has a poorer ability than water to keep the positively charged ions and the DNA apart.


Glucose for Osmolarity

50mM (millimolar) glucose sugar is added to GTE buffer to maintain osmolarity where the solute concentration outside the cells is close to that inside the cells. This prevents premature cell lysis, which can cause lower DNA yields to due to aggregation and degradation. The other components of the buffer also contribute to the osmolarity of the solution, but glucose, being a non-electrolyte, is a good choice because it does not interfere with the solution's buffer properties.


Gel Purification

Gel purification is used to recover DNA fragments after electrophoretic separation. DNA recovery from an agarose gel includes three basic steps: binding, washing and eluting from a silica column. DNA is believed to bind to silica in the presence of high salt via a salt bridge. Following binding, DNA is washed of impurities and eluted under low salt conditions disrupting this interaction.

This video goes through a step-by-step, generalized procedure for cutting out a band from the gel, gel solubilization, purification through binding to a silica column, and elution of purified DNA. In addition, the presentation discusses several tips for ensuring successful gel purification, including the importance of running an agarose gel with a marker or ladder that has DNA of known sizes.

إجراء

Gel-purification is a standard procedure performed to recover desired DNA fragments from agarose gels after electrophoretic separation. After dissolving the gel fragment and running it through a specialized filter, this procedure yields DNA freed from impurities such as salts, free nucleotides and enzymes, suitable for downstream applications.

The basic principle behind DNA recovery from agarose gel involves a sequence of bind, wash, and elute steps. Once the gel is in solubilizing buffer, it is applied onto a “spin column,” which, upon centrifugation, allows DNA molecules to selectively bind to a silica-filter while the impurities flow through into a collection tube.

DNA is able to bind to silica thanks to a high salt concentration in the gel solubilization buffer. This buffer is believed to disrupt the hydration structure around the filter and create a cation salt bridge between the strong negative charges on the filter and negative charges on the DNA. Residual impurities are removed by washing with ethanol.

Water or low salt buffer is added to the column and will 𠇎lute,” or free, the DNA from it, presumably by disrupting the cation bridge. The DNA is now purified from the gel.

The first step in the gel purification procedure involves casting the agarose gel and performing electrophoresis of the DNA samples. Once the gel-run is complete, desired DNA fragments are visualized against UV light and fragments are selected after comparing against a molecular weight standard.

If the gel is unstained, the band location can be approximately determined based on a comparison to the DNA ladder. While cutting the gel with a razor blade, one must take care to recover as much DNA as possible with as little agarose as possible.

When handling ethidium bromide stained gels and working in front of UV light, gloves and protective eyewear should be used. After cutting the desired DNA from the gel, dispose of the gel and running buffer properly, in compliance with institutional safety protocols.

Once isolated, the piece of gel is placed in a microfuge tube and weighed on a balance. Using the approximation that 100 mg of gel occupies 100 l, a volume of solublilization buffer that is 4X the gel weight is added to the gel piece. After being placed in buffer, the gel piece is incubated at around 50 C to melt the agarose.

Once melted, the solubilized gel is added onto a spin column and the solution is centrifuged, which will cause all of the DNA and other particulates to stick to the filter.

Next, the bound DNA is washed by adding 70% ethanol to the filter, followed by centrifugation, which will remove residual impurities from the filter. Flow through is discarded, and this washing step is then generally repeated up to three times. The empty filter is spun again to remove residual ethanol, and the silica filter is allowed to dry at room temperature. Water or elution buffer is added to the filter, and with another round of centrifugation, purified DNA is collected in the bottom of the tube.

The method you’ve just seen applies to gel purification with silica spin column filters. Other methods exist that make use of the same basic principles of DNA binding to silica followed by washing and elution steps. For example, silica can be mixed with DNA in a suspension called “glassmilk,” which can be pelleted and washed, and later eluted. Also, suction can be used to pull DNA through silica filters and, later, elute it. Be sure to understand your lab’s gel purification procedures.

Now that you have learned how to recover DNA from agarose gels, let us examine a few downstream applications that use DNA obtained from gel-purification.

For example, gel-purification is an intermediate step in Chromatin Immunoprecipitation, a technique that aims to isolate the regulatory proteins that bundle genomic DNA, in order to identify which sequences are being regulated. The isolated fragments are gel-purified and sequenced, in order to be mapped onto the individual chromosome regions.

Subcloning - the process of moving a gene in one vector to another - can involve gel purification. For example, gene sequences from one vector can be digested from one construct, and assembled into chimeric sequences via PCR, after which they are gel purified and put into other constructs.

Perhaps the simplest application of gel-purification is its use after long-term storage at -80 ⶬ of excised DNA bands following electrophoresis.

You have now learned how to extract DNA fragments from agarose gel, the variations of bind, wash, and elute procedures followed as per individual user-preference, and finally some of the possible downstream applications of this method. As always, thank you for watching.


شاهد الفيديو: البارت الثاني من درس تكنولوجيا ال DNA (أغسطس 2022).