معلومة

ركائز التفاعلات الكيميائية الخلوية في هذا المناعة

ركائز التفاعلات الكيميائية الخلوية في هذا المناعة



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

التعبير عن سلسلة البروتين خارج الخلية Laminin 9 alpha-4 في العضلات الهيكلية البشرية. التلوين المناعي غير المباشر بعلامة إنزيم HRP المناعي. Ob.x40.

لقد بحثت دون جدوى عن قاعدة بيانات NCBI و JSTOR وقواعد بيانات بيولوجية رئيسية أخرى للحصول على إجابة. هذا يوحي لي بأني لا أفهم ما يجري.

1. ما هي ركائز التفاعلات الكيميائية الخلوية المذكورة أعلاه للتأثير المناعي المذكور أعلاه؟


أحتاج إلى تقديم سؤال أبسط حيث يبدو أنني أعرف رد الفعل بالضبط ، لأنه من الممكن ألا يتمكن الأشخاص من الإجابة على السؤال أعلاه.

الميتوكوندريا في خلايا خط الخلايا Hep-2. اختبار الكيمياء الخلوية لإنزيم الميتوكوندريا النوعي NAHD ديهيدروجينيز. Ob.x40.

2. ما هي ركيزة التفاعل الكيميائي الخلوي؟

إجابتي:

تفاعل نازعة هيدروجين NADH هو:

NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2

الركيزة: CoQ


من الصعب فهم السؤال ، ولكن في أي تلطيخ كيميائي مناعي مثل المذكور أعلاه ، لديك نوعان مختلفان من التفاعلات:

  • ارتباط الجسم المضاد بالهدف (في هذه الحالة ، بعض اللامينين)
  • التفاعل اللوني القائم على البيروكسيديز مع DAB. يتأكسد DAB (3،3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) في وجود بيروكسيد الهيدروجين لتشكيل راسب بني ، والذي يصبح البقعة.

إن حقيقة كونه مضادًا مناعيًا غير مباشر يعني أن لديك جسمًا مضادًا أوليًا غير مترافق ضد اللامينين وجسم مضاد ثانوي ضد جزء Fc من الغلوبولين المناعي للأنواع التي نشأ فيها أول جسم مضاد. سيترافق هذا الجسم المضاد الثانوي مع HRP (بيروكسيداز الفجل ، الإنزيم المسؤول عن توليد البيروكسيدات التي ستؤكسد DAB).

للحصول على مرجع أكثر اكتمالاً للطلاء الكيميائي الخلوي المناعي ، يمكنك قراءة: http://www.ihcworld.com/_books/Dako_Handbook.pdf


20.4: المقايسات المناعية للإنزيم (EIA) والمقايسات الماصة المرتبطة بالإنزيم (ELISA)

  • بمساهمة من OpenStax
  • علم الأحياء العام في OpenStax CNX
  • اشرح الفروق والتشابهات بين EIA و FEIA و ELISA
  • وصف الاختلاف والتشابه بين الكيمياء الهيستولوجية المناعية والكيمياء الخلوية المناعية
  • وصف الأغراض المختلفة لـ ELISA المباشر وغير المباشر

على غرار اللطخة الغربية ، تستخدم المقايسات المناعية للإنزيم (EIAs) الأجسام المضادة للكشف عن وجود المستضدات. ومع ذلك ، تختلف تقييمات الأثر البيئي عن اللطخات الغربية في أن المقايسات تجرى في ألواح ميكروترية أو في الجسم الحي وليس على غشاء ماص. هناك العديد من الأنواع المختلفة من تقييم التأثير البيئي ، لكنها تشتمل جميعها على جزيء جسم مضاد ترتبط منطقته الثابتة بالإنزيم ، مما يترك المنطقة المتغيرة حرة في ربط مولد الضد الخاص بها. تسمح إضافة ركيزة للإنزيم بتصور المستضد أو قياسه كميًا (الشكل ( فهرس الصفحة <1> )).

في تقييم الأثر البيئي ، غالبًا ما تكون ركيزة الإنزيم عبارة عن كروموجين ، وهو جزيء عديم اللون يتم تحويله إلى منتج نهائي ملون. الإنزيمات الأكثر استخدامًا هي الفوسفاتيز القلوي وبيروكسيداز الفجل الذي تتوافر له ركائز مناسبة بسهولة. في بعض تقييمات الأثر البيئي ، تكون الركيزة عبارة عن جزيء الفلوروجين ، وهو جزيء غير متوهج يحوله الإنزيم إلى صورة فلورية. تسمى تقييمات الأثر البيئي التي تستخدم الفلوروجين بالمقايسات المناعية للإنزيم الفلوري (FEIAs). يمكن الكشف عن الإسفار إما بواسطة مجهر مضان أو مقياس طيف ضوئي.

الشكل ( PageIndex <1> ): المقايسات المناعية للإنزيم ، مثل ELISA المباشر الموضح هنا ، تستخدم اتحادًا إنزيمًا مضادًا لتوصيل ركيزة يمكن اكتشافها إلى موقع مستضد. قد تكون الركيزة عبارة عن جزيء عديم اللون يتم تحويله إلى منتج نهائي ملون أو جزيء فلوري غير نشط يتألق بعد تنشيط الإنزيم. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة & ldquoCavitri & rdquo / ويكيميديا ​​كومنز)

لقاح MMR هو لقاح مركب يوفر الحماية ضد الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية (الحصبة الألمانية). يتلقى معظم الناس لقاح الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية وهم أطفال ، وبالتالي يكون لديهم أجسام مضادة ضد هذه الأمراض. ومع ذلك ، ولأسباب مختلفة ، حتى الأفراد الذين تم تلقيحهم قد يصبحون عرضة لهذه الأمراض مرة أخرى في وقت لاحق من الحياة. على سبيل المثال ، قد يتلقى بعض الأطفال جولة واحدة فقط من لقاح MMR بدلاً من اللقاحين الموصى بهما. بالإضافة إلى ذلك ، قد يبدأ عيار الأجسام المضادة الواقية في جسم الفرد و rsquos في الانخفاض مع تقدم العمر أو نتيجة لبعض الحالات الطبية.

لتحديد ما إذا كان عيار الجسم المضاد في مجرى الدم للفرد و rsquos كافياً لتوفير الحماية ، يمكن إجراء اختبار عيار MMR. الاختبار عبارة عن اختبار مناعي بسيط يمكن إجراؤه بسرعة باستخدام عينة من الدم. ستشير نتائج الاختبار إلى ما إذا كان الفرد لا يزال يتمتع بالمناعة أو يحتاج إلى جرعة أخرى من لقاح الحصبة والنكاف والحصبة الألمانية.

غالبًا ما يكون الخضوع لمعيار MMR شرطًا لما قبل التوظيف للعاملين في مجال الرعاية الصحية ، وخاصة أولئك الذين سيكونون على اتصال دائم بالأطفال الصغار أو المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. في حالة إصابة عامل الرعاية الصحية بالحصبة أو النكاف أو الحصبة الألمانية ، يمكن للفرد بسهولة نقل هذه الأمراض إلى المرضى المعرضين للإصابة ، مما يؤدي إلى تفشي المرض. اعتمادًا على نتائج عيار MMR ، قد يحتاج العاملون في الرعاية الصحية إلى إعادة التطعيم قبل بدء العمل.

المناعة

أحد الاستخدامات القوية لـ EIA هو التحسين المناعي ، حيث تعزز اتحادات إنزيم الأجسام المضادة الفحص المجهري. تستخدم الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) لفحص الأنسجة بأكملها. كما هو موضح في الشكل ( PageIndex <2> ) ، يمكن تلوين قسم من الأنسجة لتصور أنواع الخلايا المختلفة. في هذا المثال ، تم استخدام mAb ضد CD8 لتلطيخ خلايا CD8 في جزء من أنسجة اللوزتين. أصبح من الممكن الآن حساب عدد خلايا CD8 ، وتحديد أرقامها النسبية مقابل أنواع الخلايا الأخرى الموجودة ، وتحديد موقع هذه الخلايا داخل هذا النسيج. قد تكون هذه البيانات مفيدة لدراسة أمراض مثل الإيدز ، حيث تكون الوظيفة الطبيعية لخلايا CD8 ضرورية لإبطاء تقدم المرض.

الكيمياء الخلوية المناعية (ICC) هي شكل آخر قيم من أشكال المناعة. بينما تشبه IHC ، في ICC ، يتم تجريد مادة المصفوفة خارج الخلية ، ويتم حفر غشاء الخلية بالكحول لجعلها قابلة للاختراق للأجسام المضادة. يسمح هذا للأجسام المضادة بالمرور عبر غشاء الخلية والارتباط بأهداف محددة داخل الخلية. يمكن تصور العضيات ومكونات الهيكل الخلوي وغيرها من الهياكل داخل الخلايا بهذه الطريقة. في حين أن بعض تقنيات ICC تستخدم EIA ، يمكن استبدال الإنزيم بجزيء فلوري ، مما يجعله مقايسة مناعية فلورية.

الشكل ( PageIndex <2> ): تم استخدام الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم ضد CD8 لتلطيخ خلايا CD8 في هذا التحضير لنخاع العظام باستخدام كروموجين. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة Yamashita M و Fujii Y و Ozaki K و Urano Y و Iwasa M و Nakamura S و Fujii S و Abe M و Sato Y و Yoshino T)

  1. ما هو الفرق بين الكيمياء المناعية والكيمياء المناعية؟
  2. ما الذي يجب أن يكون صحيحًا بالنسبة لمنتج التفاعل الأنزيمي المستخدم في الكيمياء الهيستولوجية المناعية؟

فحوصات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs)

تستخدم مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) على نطاق واسع في تقييمات الأثر البيئي. في ELISA المباشر ، يتم تجميد المستضدات في بئر لوحة ميكروتيتر. يُضاف إلى كل بئر جسم مضاد خاص بمولد ضد معين ومترافق مع إنزيم. إذا كان المستضد موجودًا ، فسوف يرتبط الجسم المضاد. بعد الغسيل لإزالة أي أجسام مضادة غير منضمة ، تتم إضافة ركيزة عديمة اللون (كروموجين). يحول وجود الإنزيم الركيزة إلى منتج نهائي ملون (الشكل ( فهرس الصفحة <1> )). في حين أن هذه التقنية أسرع لأنها تتطلب فقط استخدام جسم مضاد واحد ، إلا أن عيبها أن الإشارة من ELISA المباشر أقل (حساسية أقل).

في شطيرة ELISA ، الهدف هو استخدام الأجسام المضادة لتحديد كمية مستضد معين موجود في محلول بدقة ، مثل مستضد من مسببات الأمراض ، أو بروتين مصل ، أو هرمون من الدم أو البول لسرد أمثلة قليلة فقط. تتمثل الخطوة الأولى لشطيرة ELISA في إضافة الجسم المضاد الأساسي إلى جميع آبار لوحة ميكروترية (الشكل ( فهرس الصفحة <3> )). يلتصق الجسم المضاد بالبلاستيك عن طريق التفاعلات الكارهة للماء. بعد فترة حضانة مناسبة ، يتم غسل أي جسم مضاد غير منضم. يتم استخدام عمليات الغسل المماثلة بين كل خطوة من الخطوات اللاحقة لضمان بقاء الجزيئات المرتبطة بشكل خاص فقط متصلة باللوحة. ثم يضاف بروتين مانع (على سبيل المثال ، الألبومين أو بروتين الحليب الكازين) لربط مواقع ربط البروتين غير النوعية المتبقية في البئر. ستتلقى بعض الآبار كميات معروفة من المستضد للسماح ببناء منحنى قياسي ، وتضاف محاليل مستضد غير معروفة إلى الآبار الأخرى. يلتقط الجسم المضاد الأولي المستضد ، وبعد الغسل ، يُضاف الجسم المضاد الثانوي ، وهو جسم مضاد متعدد النكلونات مترافق مع إنزيم. بعد الغسل النهائي ، تتم إضافة ركيزة عديمة اللون (كروموجين) ، ويقوم الإنزيم بتحويلها إلى منتج نهائي ملون. يتم قياس شدة اللون للعينة الناتجة عن المنتج النهائي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. كمية اللون المنتجة (المقاسة كامتصاص) تتناسب طرديًا مع كمية الإنزيم ، والتي بدورها تتناسب طرديًا مع المستضد الملتقط. ELISAs حساسة للغاية ، مما يسمح بتحديد كمية المستضد في النانوجرام (10 & ndash9 جم) لكل نطاق مل.

في ELISA غير المباشر ، نحدد مقدار الجسم المضاد النوعي للمستضد بدلاً من المستضد. يمكننا استخدام ELISA غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة ضد أنواع عديدة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك بوريليا برغدورفيرية (مرض لايم) وفيروس نقص المناعة البشرية. هناك ثلاثة اختلافات مهمة بين ELISAs غير المباشر والمباشر كما هو موضح في الشكل ( PageIndex <4> ). بدلاً من استخدام الجسم المضاد لالتقاط المستضد ، يبدأ ELISA غير المباشر بربط مستضد معروف (على سبيل المثال ، الببتيدات من فيروس نقص المناعة البشرية) بأسفل آبار لوحة ميكروتيتر. بعد حجب المواقع غير المقيدة على الصفيحة ، يضاف مصل المريض إذا كانت الأجسام المضادة موجودة (الجسم المضاد الأولي) ، فإنها ستربط المستضد. بعد غسل أي بروتينات غير مرتبطة ، يتم توجيه الجسم المضاد الثانوي بإنزيمه المترافق ضد الجسم المضاد الأولي (على سبيل المثال ، الغلوبولين المناعي البشري). يسمح لنا الجسم المضاد الثانوي بتحديد مقدار الجسم المضاد الخاص بالمستضد الموجود في مصل المريض و rsquos من خلال شدة اللون الناتج عن تفاعل الإنزيم المترافق مع الكروموجين.

كما هو الحال مع العديد من الاختبارات الأخرى للأجسام المضادة التي تمت مناقشتها في هذا الفصل ، هناك دائمًا قلق بشأن التفاعل التبادلي مع الأجسام المضادة الموجهة ضد مستضد آخر ، مما قد يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. وبالتالي ، لا يمكننا تشخيص عدوى فيروس العوز المناعي البشري بشكل نهائي (أو أي نوع آخر من العدوى) بناءً على مقايسة ELISA غير المباشرة. يجب أن نؤكد أي اختبار إيجابي مشتبه به ، والذي يتم إجراؤه في أغلب الأحيان باستخدام إما لطخة مناعية تحدد بالفعل وجود ببتيدات معينة من العامل الممرض أو اختبار لتحديد الأحماض النووية المرتبطة بالعامل الممرض ، مثل النسخ العكسي PCR (RT-PCR) ) أو اختبار مستضد الحمض النووي.

الشكل ( PageIndex <3> ): (أ) في شطيرة ELISA ، يتم استخدام جسم مضاد أولي لالتقاط مستضد مع الجسم المضاد الأساسي. تتم إضافة جسم مضاد ثانوي مترافق مع إنزيم يتعرف أيضًا على الحواتم الموجودة على المستضد. بعد إضافة الكروموجين ، يقيس مقياس الطيف الضوئي امتصاص المنتج النهائي ، والذي يتناسب طرديًا مع كمية المستضد الملتقطة. (ب) تُظهر لوحة ELISA تخفيفات للأجسام المضادة (يسار) ومستضدات (أسفل). ينتج عن التركيزات الأعلى لون نهائي أغمق. (الائتمان ب: تعديل العمل من قبل منطقة المحيط الهادئ لخدمة الأسماك والحياة البرية الأمريكية) الشكل ( PageIndex <4> ): يتم استخدام ELISA غير المباشر لتحديد الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد في مصل المريض لتشخيص المرض. يتم إرفاق المستضد من عامل المرض المشتبه به بألواح ميكروتيتر. يأتي الجسم المضاد الأولي من مصل المريض و rsquos ، والذي يرتبط لاحقًا بالجسم المضاد الثانوي المترافق بالإنزيم. يسمح لنا قياس إنتاج المنتج النهائي باكتشاف أو تحديد كمية الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد الموجودة في مصل المريض و rsquos.

  1. ما هو الغرض من الجسم المضاد الثانوي في ELISA المباشر؟
  2. ماذا تحدد ELISA المباشر وغير المباشر؟

على الرغم من أن الاتصال واختبار 1300 مريض لفيروس نقص المناعة البشرية سيكون مضيعة للوقت ومكلفًا ، يأمل المسؤولون في تقليل مسؤولية المستشفى و rsquos من خلال البحث الاستباقي عن الضحايا المحتملين لجريمة الموظف المارق و rsquos وعلاجهم. يعد الاكتشاف المبكر لفيروس نقص المناعة البشرية أمرًا مهمًا ، ويمكن أن يؤدي العلاج الفوري إلى إبطاء تقدم المرض.

هناك مجموعة متنوعة من اختبارات الفحص لفيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن الأكثر استخدامًا هو اختبار ELISA غير المباشر. كما هو الحال مع ELISAs غير المباشر ، يعمل الاختبار عن طريق ربط مستضد (في هذه الحالة ، ببتيدات فيروس نقص المناعة البشرية) ببئر في لوحة 96 بئر. إذا كان المريض مصابًا بفيروس نقص المناعة البشرية ، فسوف ترتبط الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية بالمستضد ويتم التعرف عليها بواسطة اتحاد إنزيم الجسم المضاد الثاني.

  1. ما مدى دقة اختبار ELISA غير المباشر لفيروس نقص المناعة البشرية ، وما هي العوامل التي يمكن أن تؤثر على دقة الاختبار و rsquos؟
  2. هل يجب على المستشفى استخدام أي اختبارات أخرى لتأكيد نتائج ELISA غير المباشرة؟

الترشيح المناعي والمقايسات المناعية

في بعض الحالات ، قد يكون من الضروري اكتشاف أو تحديد كمية المستضدات أو الأجسام المضادة الموجودة بتركيز منخفض جدًا في المحلول. تم تطوير تقنيات الترشيح المناعي لجعل ذلك ممكنًا. في الترشيح المناعي ، يتم تمرير كمية كبيرة من السائل عبر غشاء مسامي إلى وسادة ماصة. سوف يلتقط مستضد متصل بالغشاء المسامي الجسم المضاد أثناء مروره بدلاً من ذلك ، ويمكننا أيضًا ربط جسم مضاد بالغشاء لالتقاط المستضد.

تم تكييف طريقة الترشيح المناعي في تطوير فحوصات الكروماتوغرافيا المناعية ، المعروفة باسم اختبارات التدفق الجانبي أو اختبارات الشريط. هذه الاختبارات سريعة وسهلة الأداء ، مما يجعلها شائعة الاستخدام في نقاط الرعاية (على سبيل المثال ، في مكتب الطبيب و rsquos) أو للاستخدام في المنزل. أحد الأمثلة على ذلك هو اختبار TORCH الذي يسمح للأطباء بفحص النساء الحوامل أو الأطفال حديثي الولادة بحثًا عن العدوى بمجموعة من الفيروسات ومسببات الأمراض الأخرى (التوكسوبلازما، الفيروسات الأخرى ، الحصبة الألمانية ، الفيروس المضخم للخلايا ، الهربس البسيط). اختبارات الحمل في المنزل هي مثال آخر مستخدم على نطاق واسع لاختبار التدفق الجانبي (الشكل ( فهرس الصفحة <5> )). اختبارات الترشيح المناعي شائعة أيضًا في البلدان النامية ، لأنها غير مكلفة ولا تتطلب تبريدًا ثابتًا للكواشف المجففة. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيا مدمجة أيضًا في بعض معدات المختبرات المتطورة.

في اختبارات التدفق الجانبي (الشكل ( فهرس الصفحة <6> )) ، يتم وضع سوائل مثل البول على وسادة ماصة على شريط الاختبار. يتدفق السائل بفعل الشعيرات الدموية ويتحرك عبر شريط من الخرزات مع وجود أجسام مضادة متصلة بأسطحها. يقوم السائل الموجود في العينة بالفعل بترطيب الكواشف الموجودة في الحالة الجافة في الشريط. ستعمل الخرزات المطلية بالأجسام المضادة المصنوعة من اللاتكس أو جزيئات الذهب الصغيرة على ربط المستضدات في سائل الاختبار. تتدفق معقدات الجسم المضاد-المستضد بعد ذلك عبر شريط ثان يحتوي على جسم مضاد مثبت ضد مولد الضد ، سيحتفظ هذا الشريط بالخرز المرتبط بمولد الضد. شريط تحكم ثالث يربط أي خرز. يشير اللون الأحمر (من جزيئات الذهب) أو الأزرق (من خرز اللاتكس) الذي يتطور عند خط الاختبار إلى اختبار إيجابي. إذا تطور اللون عند خط التحكم فقط ، يكون الاختبار سالبًا.

مثل تقنيات ELISA ، تستفيد اختبارات التدفق الجانبي من شطائر الأجسام المضادة ، مما يوفر الحساسية والنوعية. على الرغم من أنها ليست كمية مثل ELISA ، إلا أن هذه الاختبارات تتميز بأنها سريعة وغير مكلفة ولا تعتمد على معدات خاصة. وبالتالي ، يمكن أن يؤديها أي شخص في أي مكان. هناك بعض المخاوف بشأن وضع مثل هذه الاختبارات التشخيصية القوية في أيدي الأشخاص الذين قد لا يفهمون الاختبارات وقيودها ، مثل إمكانية الحصول على نتائج إيجابية كاذبة. في حين أصبحت اختبارات الحمل المنزلية مقبولة على نطاق واسع ، فإن اختبارات الكشف عن الأجسام المضادة في المنزل لأمراض مثل فيروس نقص المناعة البشرية أثارت بعض المخاوف في المجتمع الطبي. تساءل البعض عما إذا كان يجب السماح بالإدارة الذاتية لمثل هذه الاختبارات في حالة عدم وجود طاقم طبي يمكنه شرح نتائج الاختبار وطلب الاختبارات التأكيدية المناسبة. ومع ذلك ، مع توفر أعداد متزايدة من اختبارات التدفق الجانبي ، والتطور السريع لتكنولوجيا المختبر على رقاقة ([رابط]) ، فمن المرجح أن تصبح الاختبارات الطبية المنزلية أكثر شيوعًا في المستقبل.

الشكل ( فهرس الصفحة <5> ): اختبار التدفق الجانبي للكشف عن الهرمونات المرتبطة بالحمل في البول. يتحقق شريط التحكم من صحة الاختبار ويحدد خط الاختبار وجود الهرمونات المرتبطة بالحمل في البول. (الائتمان: تعديل العمل لكلاوس هوفمير) الشكل ( PageIndex <6> ): فحوصات الكروماتوغرافيا المناعية ، أو اختبارات التدفق الجانبي ، تسمح باختبار المستضد في محلول مخفف. عندما يتدفق السائل عبر شريط الاختبار ، فإنه يعيد ترطيب الكواشف. ترتبط الأجسام المضادة بالجزيئات الصغيرة بالمولد الضد في الشريط الأول ثم تتدفق إلى الشريط الثاني حيث ترتبط بجسم مضاد ثانٍ ثابت. ينتج عن هذا خط من الألوان ، اعتمادًا على لون الخرز. الثالث ، شريط التحكم يربط الخرز أيضًا للإشارة إلى أن الاختبار يعمل بشكل صحيح. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة Yeh CH و Zhao ZQ و Shen PL و Lin YC)

  1. ما هي العملية الفيزيائية التي تتطلبها طريقة التدفق الجانبي لتعمل؟
  2. اشرح الغرض من الشريط الثالث في اختبار التدفق الجانبي.

يقارن الجدول ( PageIndex <1> ) بعض الآليات الرئيسية والأمثلة لبعض تقييمات التأثير البيئي التي تمت مناقشتها في هذا القسم بالإضافة إلى اللطخات المناعية ، والتي تمت مناقشتها في اكتشاف معقدات الأجسام المضادة للمستضد.

الجدول ( فهرس الصفحة <1> ): اللطخات المناعية والمقايسات المناعية الإنزيمية
نوع الفحص آلية إجراءات محددة أمثلة
اللطخات المناعية يستخدم اتحادات إنزيم - جسم مضاد لتحديد بروتينات معينة تم نقلها إلى غشاء ماص لطخة غربية: تكتشف وجود بروتين معين الكشف عن وجود ببتيدات فيروس نقص المناعة البشرية (أو الببتيدات من العوامل المعدية الأخرى) في مصل المريض
المناعة يستخدم اتحادات إنزيم - جسم مضاد لتلطيخ جزيئات معينة على الخلايا أو داخلها الكيمياء الهيستولوجية المناعية: تستخدم لتلطيخ خلايا معينة في الأنسجة وصمة عار لوجود خلايا CD8 في الأنسجة المضيفة
مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) يستخدم اتحادات إنزيم - جسم مضاد لتقدير الجزيئات المستهدفة ELISA المباشر: يستخدم جسمًا مضادًا واحدًا للكشف عن وجود مستضد الكشف عن مستضد فيروس العوز المناعي البشري p24 لمدة تصل إلى شهر واحد بعد الإصابة
ELISA غير المباشر: يقيس كمية الجسم المضاد المنتج ضد مستضد الكشف عن الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في مصل الدم
المقايسات المناعية (التدفق الجانبي) تستخدم التقنيات التقاط مجمعات الأجسام المضادة المتدفقة ذات العلامات الملونة بواسطة الجسم المضاد الثابت لتشخيص المرض ساندويتش إليسا: يقيس كمية المستضد المرتبط بالجسم المضاد الكشف عن الأجسام المضادة لمختلف مسببات الأمراض في مصل المريض (على سبيل المثال ، العقديات السريعة ، مقياس الملاريا)
اختبار الحمل للكشف عن الغدد التناسلية المشيمية البشرية في البول

على الرغم من أن ELISA غير المباشر لفيروس نقص المناعة البشرية هو اختبار حساس ، إلا أن هناك العديد من الاعتبارات المعقدة. أولاً ، إذا تم اختبار الشخص المصاب بعد وقت قصير جدًا من الإصابة ، يمكن أن يؤدي الاختبار إلى نتائج سلبية خاطئة. عادةً ما تكون فترة الانقلاب المصلي حوالي ثلاثة أسابيع ، ولكن في بعض الحالات ، يمكن أن تكون أكثر من شهرين.

بالإضافة إلى السلبيات الكاذبة ، يمكن أيضًا أن تحدث نتائج إيجابية خاطئة ، عادةً بسبب العدوى السابقة بالفيروسات الأخرى التي تحفز الأجسام المضادة المتفاعلة. يعتمد المعدل الإيجابي الكاذب على العلامة التجارية المحددة للاختبار المستخدم ، ولكن 0.5٪ ليس بالأمر غير المعتاد. 1 بسبب احتمال وجود نتيجة إيجابية خاطئة ، يتم متابعة جميع الاختبارات الإيجابية باختبار تأكيدي. غالبًا ما يكون هذا الاختبار التأكيدي عبارة عن لطخة مناعية (لطخة غربية) يتم فيها تحديد ببتيدات فيروس نقص المناعة البشرية من المريض ودم rsquos باستخدام اتحاد إنزيم mAb الخاص بفيروس نقص المناعة البشرية. ستؤكد لطخة غربية إيجابية الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وستؤكد لطخة سلبية عدم وجود فيروس نقص المناعة البشرية على الرغم من الإليسا الإيجابي.

لسوء الحظ ، غالبًا ما تسفر اللطخات الغربية لمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية عن نتائج غير محددة ، وفي هذه الحالة ، فإنها لا تؤكد ولا تبطل نتائج ELISA غير المباشرة. في الواقع ، يمكن أن يكون معدل عدم التحديد 10 & ndash49٪ (ولهذا السبب ، بالإضافة إلى تكلفتها ، لا يتم استخدام البقع الغربية للفحص). على غرار ELISA غير المباشر ، يمكن أن تحدث لطخة غربية غير محددة بسبب التفاعل المتبادل أو العدوى الفيروسية السابقة أو اللقاحات أو أمراض المناعة الذاتية.

  1. من بين 1300 مريض يخضعون للاختبار ، كم عدد اختبارات ELISA الإيجابية الخاطئة المتوقعة؟
  2. من بين الإيجابيات الكاذبة ، كم عدد البقع الغربية غير المحددة التي يمكن توقعها؟
  3. كيف يمكن للمستشفى معالجة أي حالات يكون فيها المريض و rsquos western blot غير محدد؟

التحليل المحوسب للتفاعلات الكيميائية الخلوية لنزع الهيدروجين ودراسات الأوكسجين كطرق لتقييم وظيفة غمد الميتوكوندريا في الحيوانات المنوية للجرذان

تم إجراء تفاعلات كيميائية خلوية لنزع الهيدروجين المعتمد على NADH للميتوكوندريا (diaphorase / NADH المرتبط ببروتين الفلافوبروتين) ، نازعات الهيدروجين المعتمدة على NAD (isocitrate ، malate) و succinate dehydrogenase في الحيوانات المنوية للفئران. بالإضافة إلى التقييم المورفولوجي ، تم تقييم شدة التفاعلات باستخدام نظام تحليل الصور بالكمبيوتر (Quantimet 600 S). تم فحص شدة التفاعلات في القطع الوسطى للحيوانات المنوية عن طريق قياس الكثافة البصرية المتكاملة (IOD) ومتوسط ​​الكثافة البصرية (MOD). تم تحليل نشاط معقدات سلسلة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا أيضًا باستخدام طريقة الاستقطاب.

في مجتمع الحيوانات المنوية التي تمت دراستها ، تمتلئ جميع القطع الوسطى للحيوانات المنوية بالكامل بالفورمازان ، وهو نتاج التفاعل الكيميائي الخلوي. تتوافق هذه النتائج المورفولوجية مع القيم التي تم الحصول عليها من أجل IOD و MOD للأنزيمات المعطاة. في دراسات الأوكسجين ، أظهرت الحيوانات المنوية استهلاك الأكسجين في وجود ركائز للمجمعات الأول والثاني والرابع وكشفت الميتوكوندريا الخاصة بها عن سلامة وحساسية طبيعية للركائز والمثبطات. ومع ذلك ، كشفت دراسات الأوكسجين عن اختلافات بين الحيوانات المنوية والخلايا الجسدية. تتعلق هذه الاختلافات بتحفيز أكسدة البيروفات بواسطة مالات ، وعدم وجود تأثير حمض المالونيك على أكسدة ميثوسلفات الفينازين (متقبل للإلكترونات) وعدم وجود تأثير السيتوكروم ج على أكسدة الأسكوربات.

تتيح الطريقة الكيميائية الخلوية ، جنبًا إلى جنب مع قياسات قياس الكثافة: (1) تحديد كثافة التفاعل بشكل موضوعي (2) يتم الكشف عن الاختلافات الدقيقة والدراماتيكية في شدة التفاعل بين الحيوانات المنوية التي لا تختلف في ظل التقييم المورفولوجي للكثافة (3) ممكن يجب تحديد موقع وتقييم العيوب داخل غمد الميتوكوندريا في عدد كبير من الحيوانات المنوية. يمكن استخدام هذه الطريقة كطريقة فحص جنبًا إلى جنب مع الفحص المورفولوجي الروتيني للحيوانات المنوية. من ناحية أخرى ، يمكن أن تكشف طريقة الأوكسجين في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا عن تغيرات وظيفية مرتبطة بعمل مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي وتعرض السمات المميزة لاستقلاب طاقة الميتوكوندريا. الطرق المستخدمة مكملة وتسمح بالتقييم المعقد للميتوكوندريا في الحيوانات المنوية. يمكن استخدام كلتا الطريقتين في الدراسات التجريبية والسريرية.


طب الغدد الصماء

3.7.9.1.2 الخصائص الحركية والنوعية

لطالما كانت حركيات JHE وخصوصية الركيزة محورًا رئيسيًا لدراسات JHE ، نظرًا للإمكانات الزراعية الواضحة لهذه المعلومات. يسمح توضيح الثوابت الحركية لـ JHE أيضًا بالتنبؤ بحدود معدل استقلاب JH ، بالإضافة إلى توفير نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم مستويات JH المحيطية. يشير عدد من التقارير من الثمانينيات إلى أنه من بين قشريات الأجنحة ، فإن ثابت ميكايليس الظاهر (كم) بالنسبة إلى JHs التي تحدث بشكل طبيعي تراوحت من 10 8 إلى 10 6 M (Roe and Venkatesh ، 1990). عيار JH في الأنواع التي تم اختبارها أقل من 10 إلى 100 مرة على الأقل من المقدرة كم التركيز ، مما يشير إلى أن الإنزيم حساس جدًا للتغيرات في تركيز JH ، ولكنه يشير إلى إهدار إمكاناته التحفيزية. منذ كم تبدو القيم مرتفعة بشكل غير ملائم فيما يتعلق بتركيز الركيزة ، فقد قام الباحثون بفحص مكونات المعدل الفردي للتفاعل الأنزيمي لشرح البيانات المرصودة بشكل أفضل (Sparks and Rose ، 1983 Hammock ، 1985 Abdel-Aal and Hammock ، 1986).

في أبسط المصطلحات ، يمكن اعتبار سرعة JHE أو أي تفاعل إنزيمي على أنها مجموع مكونات المعدل المختلفة وتركيز المواد المتفاعلة ، وبالتالي يمكن تحديدها بالمعادلة المألوفة:

أين ه يمثل الانزيم ، س يمثل الركيزة ، ES تمثل مجمع Michaelis ، و ص المنتج. في ظل الظروف الفسيولوجية ، حيث يكون تركيز JH أقل بعدة مرات من الحجم كم، المعدل الذي يتكون به حمض JH هو دالة لتفاعل JH مع JHE (ك1 و ك−1) ومعدل تكوين المنتج (ك2). يمكن استخلاص العديد من الدروس المهمة من البيانات الحركية لـ JHE. أولاً ، لدى JHE تقارب كبير جدًا مع JH. ثانيًا ، لديها رقم دوران منخفض نسبيًا أو كقط، أين كقط هو الحد الأقصى لعدد جزيئات الركيزة (JH) المحولة إلى منتج (حمض JH) لكل موقع نشط لكل وحدة زمنية. هذه العوامل تجعل الإنزيم كاسحًا فعالًا للغاية يمكنه "العثور" على JH بتركيزات فسيولوجية وتحويله إلى حمض JH (Abdel-Aal and Hammock ، 1986).

تمثل خصوصية الركيزة لـ JHE خاصية أخرى تبدو غير بديهية. ال كم و الخامسالأعلى أن عرض JHEs تجاه متماثلات JH منخفض بشكل مدهش عند مقارنته بالركائز الأخرى ، مثل α-naphthyl acetate. على سبيل المثال ، المؤتلف م يعرض JHE ملف كم (410 ميكرومتر) و الخامسالأعلى (21 ميكرومول دقيقة −1 مجم بروتين −1) لخلات α-naphthyl التي تكون أعلى بكثير من الركيزة الطبيعية ، JH III (كم = 0.052 ميكرومتر ، الخامسالأعلى = 1.4 ميكرولتر دقيقة −1 مجم بروتين −1) (Hinton and Hammock، 2003). كما لاحظ Fersht (1985) ، عند استخدام الخصوصية للتمييز بين مركبين متنافسين ، يجب تحديدها بواسطة كقط/كم النسب وليس كم وحده. ال كقط/كم نسبة JH III و α-naphthyl acetate هي 27 و 0.04 ، على التوالي ، مما يؤكد الدرجة العالية من خصوصية JHE لـ JH III (Hinton and Hammock ، 2003). بينما تشير هذه المعلمات الحركية إلى أن الإنزيم لديه درجة عالية من الخصوصية ، يبدو أن JHEs من عدة أنواع تتحلل أيضًا استرات الميثيل والإيثيل لـ JH I و III بمعدلات متشابهة جدًا (Grieneisen وآخرون. ، 1997). علاوة على ذلك ، حتى ن-بروبيل و ن- يمكن أن تعمل استرات البوتيل في هذه المتجانسات بشكل فعال كركائز ، وإن كان ذلك بمعدل أقل من التحلل المائي. كما هو متوقع ، غير الطبيعي (2ض,6ه) -JH I ethyl ester isomer لا يتم استقلابه بواسطة JHEs من م أو H. virescens.

نظرًا لأن hJHBPs لها تأثير كبير على توفر الركيزة (Peter وآخرون. ، 1979 Peter ، 1990 King and Tobe ، 1993) ، يجب إجراء دراسات حول خصوصية JHE باستخدام مستحضرات نقية نسبيًا من الإنزيم. في تلك الدراسات القليلة باستخدام درجة عالية من النقاء أو المؤتلف تي ني JHE ، تم تحديد أن JHE تحلل JH I بسرعة أكبر من JH II أو III وأنه أظهر معدل تحفيزي أسرع للتشكيل الطبيعي ، (10ص,11س) -JH II ، من لـ (10س,11ص) - نموذج JH II (Hanzlik and Hammock ، 1987). ومع ذلك ، فإن مقارنة كقط/كم أشارت النسب الخاصة بالمتصاهرين إلى أن التحلل المائي للصيغتين كان متكافئًا (Hanzlik and Hammock ، 1987). وينطبق الشيء نفسه على فراشة الغجر ، ديسبار ليمانتريا، حيث لا يُظهر JHE انتقائية تماثلية ويبدو أنه غير قادر على التمييز بين المتماثلات (Valaitis ، 1991). تم العثور على واحدة من أكثر المجموعات غير المتوقعة من ركائز JHE في النافثيل و ص-سلسلة النيتروفينيل. بينما استنتج في الأصل أن الدملمف JHE من بعض الأنواع مثل م. سيكستا، لا يمكن استخدام α-naphthyl acetate كركيزة (Coudron ، 1981) ، يمكن أن تتعرف JHEs للأنواع الأخرى على أعضاء سلسلة naphthyl (Rudnicka and Kochman ، 1984 Hanzlik and Hammock ، 1987). في الآونة الأخيرة تم إثبات أن المؤتلف JHE من م, H. virescens، و تي. مولتور يمكن أن تتحلل مركبات النفتيل بالماء بمشتقات متسلسلة بطول ثمانية ذرات كربون ، وبالتالي تبدد الاعتقاد الراسخ بأن JHE من م غير قادر على استخدام مشتقات النفثيل كركائز (Kamita وآخرون., 2003 ).

ملاحظة أخرى غير بديهية هي أنه في حين أن الدور الرئيسي لـ JHE هو تحويل JH إلى حمض JH ، يمكن لكل من JHEs الأصلية والمؤتلفة من عدة أنواع ، في ظل الظروف المناسبة ، تحويل JH لتشكيل متماثلات استر أعلى ، أي JH ethyl ، JH ن-بروبيل ، و JH ن-استرات البوتيل (Grieneisen وآخرون. ، 1997). على الرغم من أن استرة JH بوساطة JHE قد تكون فضولًا يقتصر على أنبوب الاختبار ، Debernard وآخرون. (1995) أنه عندما يتم حقن JH III ، المذاب في الإيثانول (10 ميكرولتر) ، في المهاجرة ، تم تحويله إلى حمض JH III وتم تحويله إلى JH III ethyl ester. فيما يتعلق بهذه الدراسة بالذات ، تجدر الإشارة إلى أنه يجب توخي الحذر لتجنب المصنوعات اليدوية عند استخدام الكحول كمذيبات حاملة للهرمون في فحوصات JHE. ومع ذلك ، في حين أن JHE في بيئة بيولوجية يعمل بوضوح كإستريز ، فإن هذه النتائج الجديدة تشير إلى أن الإنزيم قد يكون له أدوار فسيولوجية أخرى (انظر Anspaugh وآخرون. (1995) للأدوار المحتملة الأخرى لـ JHE).


خامسا - تقييم ردود الفعل الناجم عن توطين الإستراز

تم وصف نتائج الدراسات المقارنة لأسيتات الإندوكسيل ، المستخدمة كركائز مولدة المنشأ ، في عمليات التلوين الكيميائي الخلوي للإسترات في الأنسجة الثابتة بالفورمالين. وقد لوحظت ارتباطات بين أنماط التلوين الناتجة ، والتركيبات الجزيئية للركائز والأصباغ المشتقة ، وقابلية الذوبان وجوهر الأصباغ ، ومعدلات أكسدة الإندوكسيلات المنتجة إنزيمياً. وقد أتاح ذلك الاختيار الموضوعي لأنظمة التلوين الأكثر دقة ، وأدى إلى التطوير المنهجي لأسيتات 5-bromo-4-chloroindoxyl ، وهي ركيزة محسّنة تتيح تحديد موقع الإسترات بدقة تبلغ حوالي 0-5 ميكرومتر. تشير حركية أكسدة الإندوكسيل في الأنسجة إلى أن عمليات التلوين لها إمكانات كمية كبيرة.


ركائز وكروموجينات ل IHC

يتم توجيه اختيار الكروموجين المستخدم بواسطة الإنزيم المستخدم في التجربة ، بالإضافة إلى عدد من العوامل الأخرى. هنا ، نقوم بمراجعة المبادئ التوجيهية لاختيار الركيزة الأنزيمية المناسبة للكشف عن الكروموجينيك.

وسائل الإعلام المتصاعدة

المزايا (+) والعيوب (-)

بيروكسيداز الفجل (HRP)

+ لون مكثف ، يتناقض جيدًا مع اللون الأزرق في تلطيخ مزدوج.

بيروكسيداز الفجل (HRP)

بيروكسيداز الفجل (HRP)

بيروكسيداز الفجل (HRP)

بيروكسيداز الفجل (HRP)

+ لون بديل مفيد في IHC متعدد الألوان

+ أقل كثافة ، جيد للتلطيخ المزدوج.

- Fast Blue BB عرضة للبهت.

+ أقل كثافة ، جيد للتلطيخ المزدوج.

- أحمر سريع TR عرضة للبهت.

نفتول AS-MX فوسفات + فوشين جديد

+ لون بديل مفيد في IHC متعدد الألوان

+ لا يوجد نشاط إنزيم داخلي ، لذلك لا يعاني من بيروكسيدازات داخلية تسبب تلطيخًا إيجابيًا كاذبًا.


يوفر mtDNA أول علامة معروفة تميز الهنود البدائيين عن الآخرين

علامة لفقدان الخلايا العصبية أو خلل في الميتوكوندريا. PMID: 9778562

Succinate Dehydrogenase (SDH)

mitochondrial marker enzyme. Cytochemical localization of SDH was between the outer and the inner mitochondrial membranes. PMID: 2138522

transiently expressed mitochondrial protein. PMID: 10336016

Magnesium Dependent Adenosine Triphosphatase (Mg-ATPase)

mitochondrial marker enzyme. Mg-ATPase was on the inner surface or matrix side of the inner membrane. PMID: 2138522

an enzyme marker for the outer membrane of rat liver mitochondria. PMID: 5460462, PMID: 4291912

a subunit of yeast mitochondrial ATP synthase. PMID: 9247150

a highly conserved, 30- to 32-kDa mitochondrial membrane protein, occurs in a number of unexpected isoforms, ranging from 64 to greater than 185 kDa in the mammalian sperm mitochondria, which are the ubiquitinated substrates. PMID: 12646488

an antiproliferative protein, is localized to mitochondria. PMID: 7843414

Electrophoretical visualization of SOD patterns provided evidence for possible migration of cytosolic Cu/Zn SOD to mitochondria. The characteristic Cu/Zn SOD profile in mitochondria of all tested strains suggested its ubiquity within the fermentative and respiratory yeasts. PMID: 14734161

UCP-3 protein (mitochondrial uncoupling protein-3)

is present in mitochondria isolated from rat thymus and mitochondria isolated from reticulocytes, monocytes and lymphocytes of rat spleen. PMID: 15262223

UCP-3 is predominantly overexpressed in skeletal muscle. PMID: 12630934

VDAC (voltage-dependent anion channel)

Immunogold labeling and EM analysis of the cerebellar molecular layer showed specific VDAC immunostaining of the mitochondrial outer membrane, highly enhanced in contact sites between mitochondria or between mitochondria and associated ER. PMID: 15238267

Other Mitochondria Markers

A cytochemical marker for epidermal differentiation, Langerhans cells, skin resident macrophages and mitochondria. PMID: 7138784

Diaminobenzidine cytochemistry in unfixed human epidermis: a marker for epidermal differentiation and for mitochondria. PMID: 6177799

Mitochondria DNA markers and genetic demographic processes in neolithic Europe. PMID: 9749344

Two- and three-point extranuclear crosses have been carried out via heterokaryons involving the three extranuclear mitochondrial markers of Aspergillus nidulans: (oliA1), (cs67) and (camA112). All three markers appear to be located on a single functional mitochondrial genome. PMID: 765725

Cobalt as a mitochondrial density marker in a study of cytoplasmic exchange during mating of Schizophyllum commune. PMID: 4127537

On the use of glutamate dehydrogenase as a mitochondrial marker enzyme for the determination of the intracellular distribution of rat liver pyruvate carboxylase. PMID: 11945602


Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs)

ال enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are widely used EIAs. في ال direct ELISA, antigens are immobilized in the well of a microtiter plate. An antibody that is specific for a particular antigen and is conjugated to an enzyme is added to each well. If the antigen is present, then the antibody will bind. After washing to remove any unbound antibodies, a colorless substrate (الكروموجين) is added. The presence of the enzyme converts the substrate into a colored end product (Figure 1). While this technique is faster because it only requires the use of one antibody, it has the disadvantage that the signal from a direct ELISA is lower (lower sensitivity).

في sandwich ELISA, the goal is to use antibodies to precisely quantify specific antigen present in a solution, such as antigen from a pathogen, a serum protein, or a hormone from the blood or urine to list just a few examples. The first step of a sandwich ELISA is to add the الجسم المضاد الأولي to all the wells of a microtiter plate (Figure 3). The antibody sticks to the plastic by hydrophobic interactions. After an appropriate incubation time, any unbound antibody is washed away. Comparable washes are used between each of the subsequent steps to ensure that only specifically bound molecules remain attached to the plate. A blocking protein is then added (e.g., albumin or the milk protein casein) to bind the remaining nonspecific protein-binding sites in the well. Some of the wells will receive known amounts of antigen to allow the construction of a standard curve, and unknown antigen solutions are added to the other wells. The primary antibody captures the antigen and, following a wash, the جسم ثانوي is added, which is a جسم مضاد متعدد النسيلة that is conjugated to an enzyme. After a final wash, a colorless substrate (chromogen) is added, and the enzyme converts it into a colored end product. The color intensity of the sample caused by the end product is measured with a spectrophotometer. The amount of color produced (measured as absorbance) is directly proportional to the amount of enzyme, which in turn is directly proportional to the captured antigen. ELISAs are extremely sensitive, allowing antigen to be quantified in the nanogram (10 –9 g) per mL range.

Figure 3. Click for a larger image. (a) In a sandwich ELISA, a primary antibody is used to first capture an antigen with the primary antibody. A secondary antibody conjugated to an enzyme that also recognizes epitopes on the antigen is added. After the addition of the chromogen, a spectrophotometer measures the absorbance of end product, which is directly proportional to the amount of captured antigen. (b) An ELISA plate shows dilutions of antibodies (left) and antigens (bottom). Higher concentrations result in a darker final color. (credit b: modification of work by U.S. Fish and Wildlife Service Pacific Region)

In an indirect ELISA, we quantify antigen-specific antibody rather than antigen. We can use indirect ELISA to detect antibodies against many types of pathogens, including بوريليا برغدورفيرية (مرض لايم) و فيروس العوز المناعي البشري. There are three important differences between indirect and direct ELISAs as shown in Figure 4. Rather than using antibody to capture antigen, the indirect ELISA starts with attaching known antigen (e.g., peptides from HIV) to the bottom of the microtiter plate wells. After blocking the unbound sites on the plate, patient serum is added if antibodies are present (الجسم المضاد الأولي), they will bind the antigen. After washing away any unbound proteins, the secondary antibody with its conjugated enzyme is directed against the primary antibody (e.g., antihuman immunoglobulin). ال جسم ثانوي allows us to quantify how much antigen-specific antibody is present in the patient’s serum by the intensity of the color produced from the conjugated enzyme-chromogen reaction.

As with several other tests for antibodies discussed in this chapter, there is always concern about cross-reactivity with antibodies directed against some other antigen, which can lead to false-positive results. Thus, we cannot definitively diagnose an HIV infection (or any other type of infection) based on a single indirect ELISA assay. We must confirm any suspected positive test, which is most often done using either an immunoblot that actually identifies the presence of specific peptides from the pathogen or a test to identify the nucleic acids associated with the pathogen, such as reverse transcriptase PCR (RT-PCR) or a nucleic acid antigen test.

Figure 4. Click for a larger image. The indirect ELISA is used to quantify antigen-specific antibodies in patient serum for disease diagnosis. Antigen from the suspected disease agent is attached to microtiter plates. The primary antibody comes from the patient’s serum, which is subsequently bound by the enzyme-conjugated secondary antibody. Measuring the production of end product allows us to detect or quantify the amount of antigen-specific antibody present in the patient’s serum.

فكر في الأمر

  • What is the purpose of the secondary antibody in a direct ELISA?
  • What do the direct and indirect ELISAs quantify?

Clinical Focus: HIV Part 2

This example continues the story that started in Polyclonal and Monoclonal Antibody Production.

Although contacting and testing the 1300 patients for HIV would be time consuming and expensive, administrators hoped to minimize the hospital’s liability by proactively seeking out and treating potential victims of the rogue employee’s crime. Early detection of HIV is important, and prompt treatment can slow the progression of the disease.

There are a variety of screening tests for HIV, but the most widely used is the indirect ELISA. As with other indirect ELISAs, the test works by attaching antigen (in this case, HIV peptides) to a well in a 96-well plate. If the patient is HIV positive, anti-HIV antibodies will bind to the antigen and be identified by the second antibody-enzyme conjugate.

  • How accurate is an indirect ELISA test for HIV, and what factors could impact the test’s accuracy?
  • Should the hospital use any other tests to confirm the results of the indirect ELISA?

We’ll return to this example later on this page.


Order Details

To use as substrate/chromogen in conjunction with peroxidase based immunostaining systems.
Note: The working chromogen solution is stable for 6 hours. Any solution not used after this period should be discarded.
1. Take 5 ml of distilled or de-ionized water in a test tube.
2. Add two drops of concentrated buffer and mix.
3. Add two drops of concentrated AEC Chromogen and mix.
4. Add two drops of 3% H2O2 substrate solution and mix.

إجراء:
1. Once tissue sections have been incubated with peroxidase, wash them with buffer thoroughly.
2. Wipe the class to remove excess buffer and add enough drops of the working AEC solution to cover the tissue sections.
3. Incubate for 10-20 mintues at room temperature. For the best results, look under the microscope for the signal development. Once desired signal to noise ratio is achieved, stop the reaction by washing slides in wash buffer.


المواد والأساليب

DNA constructs and transfections

pEGFP-HA-KAP1wt (wild type) and pEGFP-HA-KAP1S824A were a gift from Y Shiloh (Tel Aviv University, Israel). pEGFP-HA-KAP1S473A and pEGFP-HA-KAP1S473D were made by site-directed mutagenesis of pEGFP-HA-KAP1wt using the primers: KAP1-S473A-F, 5'-GAAACGGTCCCGCGCAGGTGAGGGCGAG-3' KAP1-S473A-R, 5'-CTCGCCCTCACCTGCGCGGGACCGTTTC-3' KAP1-S473D-F, 5'-GGTGTGAAACGGTCCCGCGACGGTGAGGGCGAGGTGAGC-3' KAP1-S473D-R, 5'-GCTCACCTCGCCCTCACCGTCGCGGGACCGTTTCACACC-3'.

Plasmid DNA was transfected with FuGENE 6 reagent (Roche Diagnostics Ltd., Burgess Hill, UK)) following the manufacturer's instructions.

Expression and purification of recombinant proteins

pFastBac-TEV-SBP-Chk1wt was prepared by amplifying Chk1 from pCIneo-FLAG-Chk1 (provided by J Bartek, Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark) and cloning it into pFastBac1-TEV-SBP (gift from P Marco-Casanova, Gurdon Institute, Cambridge, UK) via EcoRI and XbaI restriction sites. Bacmids were prepared in DH10Bac™ الإشريكية القولونية cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)) following the manufacturer's protocol. Primers for site-directed mutagenesis of Chk1 Leu84 were: Chk1L84G-F, 5'-GCAATATCCAATATTTATTTGGGGAGTACTGTAGTGGAGGAGAGC-3' Chk1L84G-R, 5'-GCTCTCCTCCACTACAGTACTCCCCAAATAAATATTGGATATTGC-3' Chk1L84A-F, 5'-GCAATATCCAATATTTATTTGCGGAGTACTGTAGTGGAGGAGAGC-3' and Chk1L84A-R, 5'-GCTCTCCTCCACTACAGTACTCCGCAAATAAATATTGGATATTGC-3'. SBP-tagged wild type and mutated Chk1 proteins were expressed in Sf9 insect cells and purified to homogeneity as described for SBP-tag purification [53]. pGEX20T-Cdc25A was a gift from J Bartek (Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark). GST-Cdc25A was expressed in BL21 بكتريا قولونية cells and purified with glutathione sepharose beads following the manufacturer's instructions.

Protein kinase assays

الجميع في المختبر kinase assays were done in Chk1 kinase buffer (50 mM HEPES, pH 7.4 13.5 mM MgCl2 and 1 mM dithiothreitol) in the presence of 1 mM Na3VO4 and 1 mM ATP or ATP analogue. Reactions were incubated for 30 minutes at 30°C and stopped by addition of 10 mM EDTA, pH 8. For western blotting, proteins were mixed with Laemmli buffer and separated on 9% SDS-polyacrylamide gels.

النشاف الغربي

Proteins were separated by SDS-PAGE. Antibodies used were: Chk1 (1:100 mouse G4 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), Chk1 phospho-Ser317 (1:1,000 rabbit Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), Chk1 phospho-Ser345 (1:5,000 rabbit Cell Signaling), Chk2 phospho-Thr-68 (1:1,000 rabbit Cell Signaling), Cdc25A (1:100 mouse Santa Cruz), Cdc25A phospho-Ser123 was provided by E Appella (National Cancer Institute, Bethesda, US), GFP (1:1,000 mouse Roche), histone H3 phospho-Ser10 (1:5,000 mouse Abcam, Cambridge, UK), KAP1 (1:500 rabbit Santa Cruz), KAP1 phospho-Ser824 (1:1,000 rabbit Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA), KAP1 phospho-Ser473 (1:1,000 rabbit BioLegend), tubulin (1:5,000 mouse Sigma Aldrich Company, Ltd., Dorset, UK), thiophosphate-ester-specific antibody (1:5,000 Epitomics, Inc., Burlingame, CA, USA) according to the manufacturers' instructions.

Large-scale kinase assay, purification of phospho-peptides and mass spectrometry

Large-scale Chk1 kinase assay and subsequent peptide enrichment was as previously described [54]. Briefly, 1 mg of HeLa nuclear extract (Cil Biotech, Mons, Belgium) was incubated with 10 μg of SBP-Chk1L84G in the presence of 1 mM Na3VO4 and 1 mM N6B-ATPγS in 1× Chk1 kinase buffer for 30 minutes at 30°C. Reactions were stopped by addition of EDTA. Trypsin digestion was done in denaturing buffer following a standard protocol. Phosphopeptides were enriched using a previously described method [16]. Briefly, 100 μl of iodoacetyl-agarose beads (SulfoLink gel, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) in 100 μl of 50% acetonitrile were added to trypsin-digested peptides. The beads were extensively washed with 2 ml each of water, 5 M NaCl, 50% acetonitrile, and 5% formic acid in water, sequentially. Phosphopeptides were eluted using 200 μl of a 1 mg/ml solution of Oxone, and purified on C18 StageTips [55]. Phosphopeptides were analyzed on a linear ion trap/Orbitrap mass spectrometer (LTQ-Orbitrap XL), as described previously [56]. Raw MS data were processed using MaxQuant [57]. Data were searched using the Mascot search engine (Matrix Science Ltd., London, UK), and peptides were identified using MaxQuant at a false discovery rate of 1% for peptides and proteins. Cysteine carbamidomethylation was searched as a fixed modification, whereas amino-terminal protein acetylation, phosphorylation of Ser, Thr, and Tyr, and oxidation of Met were searched as variable modifications. Raw MS data are available at the PeptideAtlas repository [58].

Cell culture and reagents

U2OS cells were used throughout and grown in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, and glutamine. Stable clones expressing GFP-KAP1 were selected adding G-418 (0.5 mg/ml) to the medium. Aphidicolin, caffeine, etoposide, hydroxyurea and camptothecin were from Sigma-Aldrich phleomycin was from Melford Laboratories Ltd., Ipswich, UK. IR was applied with a Faxitron X-ray cabinet. UV irradiation was done on cells covered in 1× PBS at a rate of 0.7 J/m 2 per second. AZD7762 was provided by AstraZeneca and used at 50 nM. KU55933 [36] was used at 20 μM. Caffeine was used at 4 mM. All incubations with inhibitors started 1 h before any other treatment was applied. N-6-Benzyladenosine-5'-O-triphosphate (N6B-ATP) and N-6-benzyladenosine-5'-O-(3-thiotriphosphate) (N6B-ATPγS) were from BIOLOG Life Science Institute Forschungslabor und Biochemica-Vertrieb GmbH, Bremen, Germany.

SiRNAs and transfections

siChk1 and siChk2 were with siGENOME SMARTpool siRNA (Thermo Fisher Scientific Dharmacon Products, Lafayette, CO, USA) siLuc (5'-cguacgcggaauacuucgatt-3') and siKAP1 [31] were from Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany. Transfections were done with Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Cells were treated 12 h (siChk1 and siChk2) or 48 h (siKAP1) afterwards.

تألق مناعي

Cells were grown on poly-L-lysine-coated coverslips, fixed with 2% paraformaldehyde for 10 minutes and permeabilized with 1× PBS containing 0.2% (v/v) Triton X-100 for 5 minutes. Primary antibody staining was for 1 h in 5% fetal bovine serum in 1× PBS with KAP1 phospho-Ser473 (1:100 rabbit BioLegend) and γH2AX (1:1,000 mouse Millipore, Billerica, MA, USA). Secondary antibody staining was with goat anti-mouse Alexa Fluor 488 or goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 (1:1,000 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for 30 minutes. Coverslips were washed three times with 1× PBS and mounted on slides with Vectashield solution (Vector Laboratories Ltd., Peterborough, UK) containing 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to stain DNA. All incubations were done at room temperature.


شاهد الفيديو: الاستجابة المناعية الجزء الأول (أغسطس 2022).