معلومة

ج 3. بروتين Kinase C (PKC) و Kinase المعتمد على Calmodulin (CAM-PK) - علم الأحياء

ج 3. بروتين Kinase C (PKC) و Kinase المعتمد على Calmodulin (CAM-PK) - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

سلسلة الأحداث: يربط مستقبل الغشاء بدون نشاط ENZYME إشارة كيميائية خارج الخلية ، مما يتسبب في تغيير تكوين في المستقبل الذي ينتشر عبر الغشاء. تسمى دورة تدهور وإعادة تركيب PIP2 دورة PI.

الشكل: دورة PI

تتضمن بعض الإشارات التي تنشط فسفوليباز C وتصنع IP3 و diacylglycerol ما يلي: أسيتيل كولين (فئة مختلفة عن النوع الموجود عند التقاطع العصبي العضلي الذي ناقشناه في قسم الفصل الأخير) ، أنجيوتنسين II ، الجلوتامات ، الهيستامين ، الأوكسيتوسين ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ، الفازوبريسين ، الهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية ، وهرمون إفراز الثيروتروبين. تتضمن بعض البروتينات التي تمت فسفرتها بواسطة PKC ما يلي:

أضف الجدول.

بعض الكينازات التي ينظمها الكالسيوم والكالودولين تشمل: كيناز سلسلة خفيفة من الميوسين ، كيناز PI-3 ، كينازات تعتمد على الطبابة البديلة. ينظم Ca / CAM أيضًا البروتينات الأخرى التي تشمل: adenylate cyclase (الدماغ) ، قناة Na المعتمدة على Ca ، cAMP phosphodiesterase ، calcineurin (phosphoprotein phosphatase 2B) ، قنوات شمية cAMP ، NO synthase ، وغشاء البلازما Ca / ATPase.

المساهمون

  • البروفيسور هنري جاكوبوسكي (كلية سانت بنديكت / جامعة سانت جون)

التنظيم التنافسي لدخول Ca 2+ بوساطة CaT-like عن طريق بروتين كيناز C و calodulin

يعد نظام إشارات Ca 2+ الذي تم ضبطه بدقة أمرًا ضروريًا للخلايا لتحويل المنبهات خارج الخلية ، وتنظيم النمو ، والتمييز. لقد قمنا مؤخرًا باستنساخ CaT-like (CaT-L) ، وهي قناة Ca 2+ انتقائية للغاية ترتبط ارتباطًا وثيقًا بقنوات الكالسيوم الظهارية (ECaC) وبروتين نقل الكالسيوم CaT1. يتم التعبير عن CaT-L في أنسجة إفرازية منتقاة ، كما أن تعبيرها يرتبط بشكل لافت للنظر مع الورم الخبيث لسرطان البروستاتا. يشير نمط التعبير وخصائص التخلل الانتقائية Ca 2+ إلى وظيفة مهمة في امتصاص Ca 2+ ودور في تطور الورم ، ولكن لا يُعرف الكثير عن تنظيم هذه الفئة الفرعية من القنوات الأيونية. نعرض الآن آلية كيميائية حيوية ووظيفية يمكن للخلايا من خلالها التحكم في نشاط CaT-L. يتم تنظيم CaT-L عن طريق موقع فريد من نوعه للربط بالهدوء ، والذي ، في نفس الوقت ، هدف للفسفرة المعتمدة على بروتين كيناز سي. نبيِّن أن ارتباط الكالودولين المعتمد على Ca 2+ بـ CaT-L ، والذي يسهل تعطيل القناة ، يمكن مواجهته عن طريق الفسفرة بوساطة بروتين كيناز C لموقع ربط الكودودولين.

يعد التنظيم الصارم للتوازن داخل الخلايا Ca 2+ ضروريًا لبقاء جميع أنواع الخلايا تقريبًا. على الرغم من أن الكثير معروف عن المكونات ووظائفها الفسيولوجية التي تحافظ على إشارات Ca 2+ السريعة في الأنسجة المثيرة (1 ، 2) ، إلا أن القليل معروف في الخلايا غير المستثارة. على الرغم من وجود أدلة متزايدة على حدوث تغييرات في Ca 2+ - استتباب الخلايا مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا وتصبح في النهاية خلايا سرطانية خبيثة (3) ، فإن المكونات الجزيئية التي تسبب هذه التغييرات غير معروفة إلى حد كبير. ظهرت مؤخرًا فصيلة فرعية من قنوات أيون انتقائية Ca 2+ تشارك في امتصاص Ca 2+ عبر الخلايا في الخلايا الظهارية (4 ، 5) ، وأفرادها مرتبطون بعيدًا جدًا بقنوات مستقبلات عابرة (TRP). على عكس آلية التنشيط التي تمت مناقشتها لبعض الأعضاء الكلاسيكيين في عائلة TRP للثدييات (6 ، 7) ، من غير المحتمل أن يتم إغلاق هذه القنوات الظهارية عن طريق استنفاد مخازن الكالسيوم الداخلية (5 ، 8). لقد حددنا مؤخرًا عضوًا في هذه العائلة ، يشبه بروتين نقل الكالسيوم البشري (CaT-L) ، وأظهرنا أن ملفه الفسيولوجي فيما يتعلق بالحجم الحالي وانتقائية Ca 2+ يشبه قنوات الكالسيوم الظهارية للأرانب (ECaC) (9). يتطابق تسلسلها تقريبًا مع تسلسل CaT1 البشري المستنسخ مؤخرًا (10) ، لكن نمط تعبيره في الأرومات المغذية السليمة والأرومة الغاذية المخلوية للمشيمة وخلايا أسينار البنكرياس والغدد اللعابية ، ولكن ليس في الكلى أو الأمعاء الدقيقة يختلف عن الأرانب ECaC والفئران CaT1 يتجاوز الفروق المتوقعة بين الأنواع. ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أنه في حين لا يمكن اكتشاف تعبير CaT-L في أنسجة البروستاتا الطبيعية ، فإن تعبيره يزداد عندما تخضع هذه الأنسجة لتحول خبيث إلى مراحل نقيلية تتسلل إلى بقية الجسم (9).

يشير نمط التعبير وخصائص تغلغل Ca 2+ الانتقائية لقنوات CaT-L إلى وظيفة مهمة في Ca 2 + امتصاص وربما في إمكانية التحول الخلوي. لم يتم تمييز تنظيم وتعديل ECaC ذي الصلة بشكل جيد ، وبالنظر إلى حقيقة أن CaT-L يُظهر تماثلًا إجماليًا منخفضًا للغاية (هوية تسلسل 13-19 ٪) لأفراد أفضل تميزًا في عائلة TRP "الكلاسيكية" ، مثل ذبابة الفاكهة TRP و TRPL (للمراجعة ، انظر المراجع 11-13) ، بحثنا في تنظيم التغذية الراجعة لنشاط قناة CaT-L. لقد أظهرنا أن تعطيل CaT-L هو عملية متعددة الأطوار ذات طور سريع يعتمد على الكالسيوم ومرحلة لاحقة تعتمد على الكالسيوم كاليمودولين (Ca 2+ -CaM). نوضح كذلك من خلال التحليلات الكيميائية الحيوية والوظيفية أن التعطيل المعتمد على الكودودولين يمكن مواجهته عن طريق الفسفرة من خلال بروتين كيناز C (PKC).


مقدمة

تنتمي Protocadherins (Pcdhs) إلى عائلة cadherin الفائقة ، وهي مجموعة من جزيئات التصاق الخلايا المعروف عنها أنها تلعب أدوارًا مهمة في العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك التشكل الجنيني ، وتشكيل الدائرة العصبية ، وتكوين الأوعية الدموية ، والسرطان 1،2،3. المجمعة Pcdhs ، وتتألف من

60 بروتينًا مشفرًا بثلاث مجموعات جينية ترادفية (بكدها ، بشدها، و Pcdhg) على كروموسوم بشري 5q31 (كروموسوم 18 في الفأر) ، تمثل أكبر مجموعة فرعية داخل عائلة كادرين 4.5. في حدود Pcdha و Pcdhg مجموعات ، إكسونات كبيرة "متغيرة" تشفر 6 تكرارات كادرين خارج الخلية (EC) ، مجال عبر الغشاء ، ومجال حشوي متغير (VCD) يتم التعبير عنها من المروجين الخاصين بهم وتقسيمهم إلى ثلاثة إكسونات ثابتة قصيرة ترميز مجال C- طرفي مشترك بواسطة كل α- أو γ-Pcdhs (β-Pcdhs ليس لديها هذا المجال المشترك وبالتالي يتم تشفير كل منها بواسطة exon واحد Pcdhg مخطط الكتلة في الشكل 1 أ) 4،6،7. يتم التعبير عن Pcdhs العنقودية ، كمجموعة ، بقوة في جميع أنحاء الجهاز العصبي النامي والناضج 8،9،10،11،12 ، مع اكتشاف مستويات أقل في أعضاء أخرى مثل الرئة والكلى 13،14. يتم تنظيم التعبير عن جينات Pcdh الفردية المجمعة بشكل تفاضلي في كل خلية عبر مثيلة المروج والتفاعل مع العناصر التنظيمية البعيدة 15،16،17،18. يشير تحليل RT-PCR أحادي الخلية إلى أن كل خلية عصبية تعبر عن جزء بسيط من الـ 14 Pcdha, 22 Pcdhbو 22 Pcdhg يتم التعبير عن معظم الجينات بطريقة عشوائية ومتفرقة ، على الرغم من 5 جينات من النوع الفرعي "C" (Pcdhac1 ، Pcdhac2 ، Pcdhgc3 ، Pcdhgc4 ، و Pcdhgc5) يتم التعبير عنها في كل مكان 19 ، 20 ، 21. جميع نماذج Pcdhs المجمعة رابطة الدول المستقلة-multimers التي تتفاعل بطريقة محبة للمثليين تمامًا في عبر 22,23,24 .

(أ) تخطيطي للماوس Pcdhg مجموعة الجينات (أعلى) ، مع أمثلة على تنشيط المروج ، ونسخ الجينات ، والربط. يتم تخطيط نصوص الأمثلة والبروتينات الناتجة أدناه. يتم ترميز كل من الأشكال الإسوية الـ 22 بواسطة 4 exons: 1 متغير exon (ظلال من اللون الأرجواني أو الأزرق يشفر 6 نطاقات EC ، مجال عبر الغشاء ، و VCD) و 3 exons ثابت (أسود ترميز مجال C مشترك). EC: كاديرين خارج الخلية يكرر VCD: المجال السيتوبلازمي المتغير CON: منطقة ثابتة. (ب) تم إجراء فحوصات TOPFlash بواسطة البلازميدات المتغيرة المشتركة التي ترميز الأشكال الإسوية γ-Pcdh الفردية باستخدام SUPER-TOPFlash و رينيلا لوسيفيراز البلازميدات في خلايا HEK293. تم فحص lysates الخلية لنشاط luciferase بعد 24 ساعة من التعرض لـ Wnt3a CM. يتم تقديم النتائج على أنها "مؤشر استجابة Wnt" ، والذي يُعرَّف بأنه تغيير أضعاف في وحدات Luciferase النسبية (نسبة RLU من luciferase اليراع إلى رينيلا luciferase [التحكم في كفاءة تعداء]) بعد علاج Wnt في الخلايا المنقولة بالأشكال الإسوية γ-Pcdh الفردية مقارنةً بتلك الموجودة في الخلايا التي تعبر فقط عن تحكم سلبي لـ GFP. وبالتالي ، فإن استجابة Wnt الخلوية للتحكم (GFP فقط) هي خط الأساس ("0") ، والتلاعبات التي تزيد من تلك الاستجابة تعطي مؤشرًا إيجابيًا ، في حين أن تلك التي تقلل هذه الاستجابة تنتج مؤشرًا سلبيًا. العديد من الأشكال الإسوية γ-Pcdh المنتظمة بشكل كبير في نشاط إشارات Wnt ، بينما فقط γ-Pcdh-C3 تنخفض بشكل كبير إشارات Wnt. يتم تقديم البيانات على مقياس log2 للوسائل ± SEM من 6 تجارب مستقلة. تم إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Bonferroni اللاحق (لتصحيح المقارنات المتعددة) لتقييم الأهمية الإحصائية. * p & lt 0.05 ، و ** p & lt 0.01.

تلعب Pcdhs المجمعة أدوارًا حاسمة في النمو العصبي. باستخدام التأسيسية والشرطية Pcdhg طفرات الفأر ، أظهرنا أن γ-Pcdhs تنظم بقاء الخلايا العصبية 11،25 ، وتكوين المشابك 26،27 ، وتفاعلات الخلايا العصبية النجمية 26 ، والتشجير التغصني 8،28،29 ، والنقش المحوري 30. في خلايا amacrine starburst الشبكية ، فإن γ-Pcdhs مطلوبة أيضًا للتجنب الذاتي للتشعب الطبيعي 31،32 ، مما يؤكد أهمية هذه العائلة للتشكيل المناسب لأشكال التغصنات. يتم التأكيد على الأهمية النسبية لـ γ-Pcdhs من خلال حقيقة أن الفئران التي تفتقر إلى جميع الأشكال الإسوية البالغ عددها 22 تموت بعد وقت قصير من الولادة 7 ، على عكس ما هو قابل للحياة وخصب. Pcdha العدد 33. ومع ذلك ، فقد ثبت أن α-Pcdhs تنظم تشجر التغصنات وتشكيل العمود الفقري التغصني 34 ، وكذلك استهداف محور عصبي 33،35،36،37 ، في مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية.

ومن المثير للاهتمام ، أن γ-Pcdhs قد تم تورطها مؤخرًا على أنها مثبطات محتملة للورم ، من خلال تثبيط إشارة Wnt الكنسية 13. حدد تحليل على مستوى الجينوم لفرط الميثيل المحفز في ورم ويلمز ، وهو سرطان الكلى عند الأطفال ، جينات Pcdh المجمعة على أنها مفرطة الميثيل باستمرار ، لا سيما تلك التي تشفر γ-Pcdhs ، يتم إسكاتها بالفعل في الخلايا السرطانية. ضربة قاضية للجميع Pcdhg الجينات (باستخدام siRNA التي تستهدف المنطقة الثابتة) في خطوط خلايا الكلى أدت إلى زيادة إشارات Wnt الكنسي ، في حين أن الإفراط في التعبير عن الفرد Pcdhg مثبطت (كدنا) مسار Wnt وأدت إلى انخفاض نمو الخلايا السرطانية في فحوصات أجار لينة 13. الشكل الإسوي γ-Pcdh-C3 المعبر عنه في كل مكان (مشفر بواسطة Pcdhgc3) بالمثل تم إسكاته في خلايا سرطان القولون والمستقيم ، وتقليل نمو هذه الخلايا عند الإفراط في التعبير عن طريق تثبيط مسار Wnt-mTOR 38. جنبا إلى جنب مع دراسات أخرى تحدد المثيلة الشاذة لـ Pcdhga11 في الأورام النجمية 39 ، Pcdhb الجينات في الورم الأرومي العصبي 40 و Pcdhg الجينات في الخلايا الخبيثة التي يسببها التسمم 41 ، تشير هذه البيانات إلى أن فهم كيفية تنظيم Pcdhs العنقودية لمسارات نمو الورم سيكون ذا أهمية انتقالية في المستقبل. بشكل مثير للاهتمام ، يمكن أن تؤثر δ-Pcdh غير العنقودية والمعروفة باسم PAPC / Pcdh8 / Arcadlin أيضًا على مسارات الكنسي 42 وغير المتعارف عليها 43،44 Wnt ، مما يشير إلى أن Pcdhs بشكل عام قد تكون ذات أهمية لفهمنا لبيولوجيا Wnt.

هنا ، قمنا بالتحقيق في الآليات الجزيئية التي من خلالها يثبط γ-Pcdh-C3 إشارة Wnt الكنسية ، وهو مسار أورام معروف جيدًا له أهمية قصوى للعديد من الخطوات في التطور العصبي 45 ، 46. يمكن أن يؤدي ربط روابط Wnt إلى Frizzled والمستقبلات المشتركة Lrp5 / 6 أو Ryk أو ROR إلى تنشيط ثلاثة مسارات متميزة على الأقل: المسار الأساسي (β-catenin / TCF) و PCP (قطبية الخلية المستوية) و Wnt-Ca2 + 47،48،49. في المسار المتعارف عليه ، تم العثور على كاتينين بيتا في مجمع يشمل Axin1 و Adenomatous Polyposis Coli (APC) و GSK3β في غياب Wnt ligand (تمت مراجعة حالة OFF في Clevers and Nusse ، 2012). يعمل Axin1 كسقالة لـ "مجمع التدمير": GSK3β phosphorylates β-catenin ، والذي يتم بعد ذلك استهدافه للتحلل المعتمد على اليوبيكويتين بواسطة البروتيازوم. في وجود يجند Wnt (الحالة ON) ، يرتبط Disheveled (Dvl) عند الطرف C لـ Frizzled 51 ويجند Axin1 إلى الذيل السيتوبلازمي لـ Lrp5 / 6 ، مما يسهل فسفرة Lrp5 / 6 بواسطة GSK3β و CK1 52 ، 53،54،55،56،57. يُعتقد أن Phospho-Lrp6 يثبط نشاط GSK3β بشكل مباشر في مجمع التدمير ، مما يؤدي إلى تقليل الفسفرة في β-catenin وكذلك Axin1 نفسه. ينفصل Axin1 منزوع الفسفرة عن معقد المستقبل النشط وأيضًا عن β-catenin ، وبالتالي يعطل مجمع التدمير حتى يتم فسفرة Axin1 مرة أخرى 55،58. يُعتقد أن تعطيل مجمع التدمير هذا يسمح بتراكم β-catenin في السيتوبلازم والانتقال إلى النواة. هناك ، يزيح مثبطات Groucho / TLE المرتبطة بعوامل النسخ TCF (عامل الخلية T) / LEF (عامل محسن اللمفاوي) ، وبالتالي تنشيط الجينات المستهدفة Wnt ، بما في ذلك العديد من الجينات التي تعزز تكاثر الورم أو تنظم نمذجة الدماغ ، والتشجير ، والتشكيل العصبي 45 ، 50،59.

على الرغم من تورط γ-Pcdhs في تنظيم Wnt للإشارة 13،38 ، فإن الآليات الجزيئية الأساسية غير معروفة. هنا ، نوضح أن γ-Pcdh-C3 ، ولكن ليس γ-Pcdhs الأخرى ، يمنع بشكل كبير التنشيط الخارجي لإشارات Wnt الكنسية في الخلايا المستزرعة ، ويحدد VCD الخاص بـ C3 كموقع مهم للعمل. على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن إمكانية شق المجال داخل الخلايا لـ γ-Pcdhs ونقله إلى النواة 60،61 ، فإننا نظهر أن C3 VCD يعمل على الغشاء ، وليس النواة ، لمنع إشارة Wnt. نوضح أيضًا أن C3 VCD يتفاعل جسديًا ومباشرًا مع مجال DIX الخاص بـ Axin1 ، ونقدم دليلاً على أنه يتنافس على موقع الربط هذا مع Dvl1. يؤدي ربط Axin1 إلى C3 VCD إلى تثبيت Axin1 على الغشاء ويمنع فسفرة Lrp6 ، مما يشير إلى أنه في هذا السياق ، يمكن أن يؤدي توطين الغشاء إلى استقرار مجمع تدمير cat-catenin. أخيرًا ، نستخدم خط الماوس لمراسل إشارات Wnt وأليل γ-Pcdh-C3 المفرط في التعبير لإظهار أن زيادة مستويات C3 تقلل من إشارات Wnt الداخلية في القشرة الدماغية للفأر في الجسم الحي. تحدد هذه البيانات معًا آلية جزيئية جديدة يمكن من خلالها أن تؤثر γ-Pcdhs على إشارات Wnt ، وتحدد Axin1 كأول شريك إشارات معروف داخل الخلايا للشكل الإسوي γ-Pcdh-C3 المعبر عنه على نطاق واسع.


يؤدي انشقاق Caspase-3 بوساطة ROCK I إلى إحداث فسفرة MLC ونزف غشاء موت الخلايا المبرمج

زيادة الفسفرة في سلسلة ضوء الميوسين (MLC) ضرورية لنبض الغشاء الديناميكي الذي يتم ملاحظته في بداية موت الخلايا المبرمج. هنا نحدد ROCK I ، مستجيب لـ GTPase Rho الصغير ، كركيزة جديدة للكاسبيسات. يتم شق ROCK I بواسطة caspase-3 بتسلسل DETD1113 / G محفوظ ويتم إزالة المجال المثبط للطرف الكربوكسي ، مما يؤدي إلى نشاط كيناز غير منظم وتأسيسي. من المعروف أن بروتينات ROCK تنظم فسفرة MLC ، وتظهر الخلايا المبرمجة زيادة تدريجية في مستويات MLC المصاحبة للفوسفور مع انقسام ROCK I. يتم إلغاء هذه الفسفرة ، وكذلك الغشاء البليبيز ، عن طريق تثبيط الكاسبيسات أو بروتينات ROCK ، لكن كلا العمليتين مستقلتان عن نشاط Rho. نظهر أيضًا أن التعبير عن ROCK I المقطوع النشط يؤدي إلى إزاحة الخلايا. وبالتالي ، يبدو أن تنشيط ROCK I بواسطة caspase-3 مسؤول عن تكوين الفقاعات في الخلايا المبرمجة.


الملخص

Neuroglia ، "الغراء" الذي يملأ الفراغ بين الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي ، يلعب دورًا نشطًا في إشارات الخلايا العصبية. الخلايا العصبية الدبقية ، والنجوم النجمية ، والقليل التغصن ، والخلايا الدبقية الصغيرة ، تتشابه معًا في عدد الخلايا العصبية في الدماغ ككل ، وفي المادة الرمادية في القشرة الدماغية ، لكن النسبة تختلف اختلافًا كبيرًا بين مناطق الدماغ. ومع ذلك ، فإن الحجم الدبقي أقل من خمس حجم الأنسجة في المادة الرمادية. عندما يتم تحفيزها بواسطة الخلايا العصبية أو الخلايا الأخرى ، تطلق الخلايا العصبية الناقلات الدبقية عن طريق الإفراز الخلوي ، على غرار إطلاق الناقل العصبي من النهايات العصبية ، أو عن طريق النقل بوساطة الناقل أو تدفق القناة عبر غشاء البلازما. تشمل الناقلات الدبقية الناقلات العصبية الشائعة الغلوتامات و GABA ، والحمض الأميني غير القياسي d -serine ، والفوسفات عالي الطاقة ATP ، و L -lactate. الجزيء الأخير هو "حاجز" بين التمثيل الغذائي للجليكوليت والتأكسد بالإضافة إلى مادة تأشير أظهرت مؤخرًا أنها تعمل على مستقبلات اللاكتات المحددة في الدماغ. تكملة النقل العصبي عند المشبك ، غالبًا ما يشير انتقال الخلايا العصبية إلى انتشار المرسل على مسافة أطول ويتفق مع مفهوم انتقال الحجم. يُعدِّل الانتقال من الخلايا الدبقية النقل العصبي المشبكي بناءً على الظروف النشطة والموضوعية الأخرى في حجم الأنسجة المحيطة بالمشابك الفردية. يبدو أن انتقال الخلايا العصبية يساهم بشكل كبير في وظائف المخ مثل الذاكرة ، وكذلك في أمراض الأعصاب السائدة.


شاهد الفيديو: الانزيمات ونشاطها. Enzyme activity. مختبر العلوم حياتية عملية (أغسطس 2022).